アッセイ方法

专利摘要:
基質での再構成活性酵素の作用を通じてグロー発光シグナルを生成させるために、検体とのインタラクタードメインの親和性を通じ、試料中の関心のある検体の存在下で第一及び第二のレポーター断片対メンバーが会合できるようにするインビトロアッセイ条件下で、（ｉ）関心のある検体に対する親和性を有するインタラクタードメインを含む精製された第一のレポーター断片対メンバーと、（ｉｉ）関心のある検体に対する親和性を有するインタラクタードメインを含み、関心のある検体との第一及び第二のレポーター断片対メンバーのインタラクタードメインの親和性を通じた第一のレポーター断片対メンバーとの会合時に活性酵素を再構成することにおいて操作可能な、精製された第二のレポーター断片対メンバーと、試料を接触させ；グロー発光シグナルの有無又は程度を検出することを含む、試料中の関心のある検体の存在を調べるための方法を記載する。
公开号:JP2011508596A
申请号:JP2010540989
申请日:2008-12-24
公开日:2011-03-17
发明作者:デ・ラス・ヘラス，レイチエル；フライ，スコツト・ロバート；ホアン，チヤン−イー；リー，ジユン
申请人:アレル・スウイツツアーランド・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング；
IPC主号:C12Q1-26

专利说明:

[0001] 本発明は、全般的に、分子生物学及び診断の分野に関する。とりわけ、本発明は、グロー発光に基づくインビトロ強制酵素再構成アッセイに関する。]
背景技術

[0002] 疾患の臨床診断のための酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの不均一酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）は、それが高感度及び特異性であるため、数十年にわたり診断産業で非常に重要なものである。不均一ＥＩＡと組み合わせ、発光基質（この感度は従来の比色及び蛍光基質よりも数桁大きい。）の使用が増えたことにより、検出限界がさらに改善された。しかし、不均一ＥＩＡに関連する原理的欠点は、その操作時間が長く、複数回の洗浄及び温置段階が必要であり、これにより自動化のために特殊計装が必要となることである。]
[0003] 次第に、感度を高め、操作を簡便にすることが必要とされていることから、代替的な発光プラットフォーム技術を生み出すために活発な動きが出てきた。化学発光及び／又は生物発光を説明するために、発光は広く本明細書中で使用される。発光検出法により、通常、それぞれ蛍光又は比色酵素基質により可能であり得るものよりも、感度が最大で１００−１０００倍高くなる（Ｏｌｓｅｎら、２０００、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．３２６：１７５−２０２）。結果として、発光により、直線性が広く、生来のバックグラウンドが低い、より大きいダイナミック・レンジ（図１で述べられるように）がもたらされる（Ｆａｎ及びＷｏｏｄ、２００７、Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ、５（１）：１２７−１３６）。さらに、均一アッセイにより、１つの溶液中で、酵素標識された検体複合体（例えば抗体−抗原複合体）の形成及び検出が可能となり、これにより、固体支持体が不要となり、より単純で迅速なアッセイが可能となる。従って、発光均一ＥＩＡによって、操作の必要条件が限定され、感度が鋭敏である、単一反応容器中での疾患診断のための代替的プラットフォームが与えられる。固体支持体及び未結合標識を除去するための洗浄が排除されることで、高スループットの自動化免疫アッセイのための化学分析装置に対する均一ＥＩＡの利用に対して顕著な長所がもたらされる。] 図１
[0004] インビボでのタンパク質−タンパク質相互作用の検出のための分割レポータータンパク質を利用するアッセイは、強制的酵素再構成（ＦＥＣ）アッセイ又はタンパク質断片再構成アッセイ（ＰＣＡ）として知られる。これらのアッセイは、全般的に、例えば：ＷＯ０１／７１７０２；米国特許第６，２７０，９６４号；同第６，２９４，３３０号；同第６，４２８，９５１号；同第６，３４２，３４５号、同第６，８２８，０９９号及び米国特許出願公開第２００３０１７５８３６号に記載されている。ＦＥＣの基礎となる基本原則は、検出可能なシグナルを生成させる活性レポータータンパク質になるように機能的に構築し得る、再構成するタンパク質断片対の使用である。アッセイの機能性の中核は、レポータータンパク質断片に連結されている断片対の各メンバー内に存在する認識部分に対する独立した標的（検体）の結合を介した、レポータータンパク質断片の再構築である。本明細書中で使用される場合、これらの相互作用部分は、「インタラクター」又は「インタラクタードメイン」と呼ばれる。インタラクタードメインは、断片対コンストラクトの各メンバー内に含有される個別の部分又はドメインであり、以下に限定されないが、疾患特異的抗原、抗体又はタンパク質結合パートナーを含む。インタラクタードメインは、レポーター断片ドメインに直接連結され得るか、又はリンカードメインにより連結され得る。タンパク質断片対メンバーは、通常、インタラクタードメイン標的非存在下で、レポーター断片が自発的に機能的に再構築しないように構築される。従って、この対の各メンバーのインタラクタードメインは、インタラクタードメインに対する標的の結合を通じて、その断片からの機能的なレポータータンパク質の再構成に役立つ。]
[0005] いくつかの様々なレポータータンパク質を用いて、機能的なインビボＦＥＣアッセイが構築された。例えば、ＷＯ０１／７１７０２；米国特許第６，２７０，９６４号；同第６，２９４，３３０号；同第６，４２８，９５１号；同第６，３４２，３４５号、同第６，８２８，０９９号及び米国特許出願公開第２００３０１７５８３６号で開示されているものを参照。しかし、ＦＥＣアッセイのインビトロ適用には、製造及び品質保証目的のための、特徴が明確である特性を有する、純粋で可溶性で安定であり活性のある酵素断片の調製を含む、特有の課題がある。発光シグナルを生成させるＦＥＣアッセイのインビトロ使用は、これらの特有の課題を解決するために必要であるだけではなく、臨床検査室での検出に適切な出力シグナルを生成させるためにも必要である。感度レベルを最大にし、ダイナミックレンジを得るために、２種類の形式−フラッシュ又はグローの何れかで、起こり得る発光検出を調べることができる。両検出法とも、有益性及び欠点があり、何れかの使用は通常、特定のアッセイ必要条件により支配される。]
[0006] インビトロタンパク質−タンパク質相互作用測定の分野において、グロー発光は、反応速度の速度論的定量を可能とし、フラッシュ発光で与えられるエンドポイント読み取りよりも本質的に感度が高い。グロー発光検出が総検出モダリティーの１３％を占め、一方でフラッシュ発光はまだその初期段階にあることを示す、現在の多モードマイクロプレートリーダーの傾向により、グロー発光の使用が好まれることは明らかであり、（ＨＴＳｔｅｃ ２００７ Ｍａｒｋｅｔ Ｒｅｐｏｒｔ）。シグナル生成に対する定常動態的アプローチであり、長時間持続する（分から時間）グロー発光と比較して、フラッシュ発光は本質的に過渡的であり、秒又はミリ秒内に最大光強度に到達する。フラッシュ発光は、装置上での試薬分注、混合及び測定を必要とするので、グロー発光のその他の利点は殆どが器具の使用に関するものである。フラッシュ発光は、光の放射が迅速であるので、ウェルごとに行われ（ウェル方式）；従って、液体注入器及び検出スループットによりアッセイの融通性が低いので、診断目的に対してその利用が限定される。一方、グロー発光試薬は、読み取り装置の外側で添加することができ、発光測定はプレート全体で行うことができる（プレート方式）。注入器は必要なく、プレート処理において融通性がより高く、１回の試薬添加及び温置が行われ得る。この理由のために、グロー発光検出は現在のＥＩＡ液体操作機器に適合するので、一般にグロー発光はＥＬＩＳＡ市場にとって好まれる検出法となっている。多重モード検出を使用して反応シグナルを多重化することにより、インビトロ目的に対する１回の反応で、比色及び発光；蛍光及び発光；フラッシュ及びグロー発光を組み合わせることにより、グロー発光は二重検体検出のさらなる長所ももたらす。]
[0007] ルシフェラーゼとして知られる発光レポーター酵素は、一般に生物発光として知られるプロセスにおいてオキシルシフェリンへのルシフェリンの酸化の結果として、検出可能な光子放射を生じさせる（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４：１９７−２３０）。いくつかのルシフェラーゼが分割され、ＰＣＡを介してタンパク質−タンパク質相互作用を測定するために良好に使用されてきたが、これには、Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（２４）：１５６０８−１５６１３及びＰａｕｌｍｕｒｕｇａｎら、２００７、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７９（６）：２３４６−２３５３におけるホタル、フォチナス・フィラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ、Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎら、２００３、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５（７）：１５８４−１５８９及びＫａｉｈａｒａら、２００３、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５（１６）：４１７６−４１８１におけるウミシイタケ、レニラ・レミフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｍｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ及びＲｅｍｙら、２００６、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３（１２）：９７７−９９９における海洋カイアシ類（ｍａｒｉｎｅ ｃｏｐｅｐｏｄ）ガウシア・プリンセプス（Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ）ルシフェラーゼが含まれる。]
[0008] 生物発光ＦＥＣの原理に基づく広く利用可能なインビトロ均一アッセイの構築には、均一アッセイ方式内でのＦＥＣの設計及び遂行に関する新たな課題がある。これらには、以下に限定されないが、ある種の発光出力シグナル、均一アッセイ方式内で生じる特定のアッセイ環境、検出しようとする検体の性質及び起源及びこのような均一アッセイの構築に伴う製造課題が含まれる。]
[0009] 使用における、特異性、信頼性、製造の簡便性及びロバストな特性を確保するために、均一アッセイは通常、単離精製成分から構成される。適切なタンパク質断片対（適切なレポーター断片、インタラクタードメイン、連結ドメイン及び全融合コンストラクト又はそれぞれを組み込むレポーター断片対を含む。）の設計ならびに、インビトロ診断用途のために製造するための、必要な可溶性、安定性及び順応性も生み出すロバストなアッセイ条件は、広く利用可能な均一アッセイプラットフォームを作製するために極めて重要である。インビボＰＣＡアッセイ条件とは対照的に、インビトロ診断アッセイ条件は、細胞外であり、比較的厳しく、インビボで容易に起こり得る適切なタンパク質折り畳み及びタンパク質−タンパク質相互作用を促し得ない。]
[0010] 発光基質を使用する生物発光ウミシイタケルシフェラーゼレポータータンパク質の利用及び使用から、断片安定性、基質自己発光と関連する問題及び特にフラッシュ発光ではなく、長時間発光型発光シグナルの生成を含むさらなる課題が生じる。従って、通常インビトロアッセイにおいてＦＥＣを実施する課題に加えて、インビトロ均一アッセイプラットフォームでの発光ＦＥＣの実施によりもたらされるさらなる課題がある。]
[0011] さらに、発光に基づく均一アッセイプラットフォームの開発の中核は、洗浄段階の排除であり、従って、血清又は少なくともある血清成分存在下で診断試験が行われ得る。このようにして、洗浄せずに、おそらく均一プラットフォームのままで（特に、血清成分又はその他の夾雑物ゆえの交差反応性、妨害及阻害的な影響を受けやすい発光ＦＥＣに基づくもの）、検体を含有する試料断片を処理し得る。]
[0012] 国際公開第０１／７１７０２号
米国特許第６，２７０，９６４号明細書
米国特許第６，２９４，３３０号明細書
米国特許第６，４２８，９５１号明細書
米国特許第６，３４２，３４５号明細書
米国特許第６，８２８，０９９号明細書
米国特許出願公開第２００３０１７５８３６号明細書]
先行技術

[0013] Ｏｌｓｅｎ他、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．３２６、２０００年、ｐ．１７５−２０２
Ｆａｎ及びＷｏｏｄ、Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ、５（１）、２００７年、ｐ．１２７−１３６
ＨＴＳｔｅｃ、Ｍａｒｋｅｔ Ｒｅｐｏｒｔ、２００７年
Ｗｉｌｓｏｎ他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４、１９９８年、ｐ．１９７−２３０
Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（２４）、２００２年、ｐ．１５６０８−１５６１３
Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ他、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７９（６）、２００７年、ｐ．２３４６−２３５３
Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ他、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５（７）、２００３年、ｐ．１５８４−１５８９
Ｋａｉｈａｒａ他、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５（１６）、２００３年、ｐ．４１７６−４１８１
Ｒｅｍｙ他、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３（１２）、２００６年、ｐ．９７７−９９９]
[0014] 本発明は、グロー発光シグナルを生じさせる分割酵素レポーター系を用いた高感度均一ＦＥＣアッセイの良好な開発に基づく。発明者らは、高感度（１００％）及び特異的（１００％）に検体を検出することでの、このような系の使用を明らかにした。従って、発明者らは、診断関連標的の検出に対する長時間発光型グロー発光に基づくインビトロ均一ＦＥＣアッセイの良好な利用を明らかにした。さらに、必要とされる時間枠（およそ１時間）は、病理検査室にこの方法を持ち込むのに適切である。従って、本発明は、現在の免疫診断分野に顕著な長所をもたらす。]
[0015] 従って、第一の態様において、本発明は、
基質での再構成活性酵素の作用を通じてグロー発光シグナルを生成させるために、検体とのインタラクタードメインの親和性を通じ、試料中の関心のある検体の存在下で第一及び第二のレポーター断片対メンバーが会合することを可能にするインビトロアッセイ条件下で、
（ｉ）関心のある検体に対する親和性を有するインタラクタードメインを含む精製された第一のレポーター断片対メンバーと、
（ｉｉ）関心のある検体に対する親和性を有するインタラクタードメインを含み、関心のある検体との第一及び第二のレポーター断片対メンバーのインタラクタードメインの親和性を通じた第一のレポーター断片対メンバーとの会合時に活性酵素を再構成することにおいて操作可能である、精製された第二のレポーター断片対メンバーと、
試料を接触させ、
グロー発光シグナルの有無又は程度を検出することを含む、
試料中の関心のある検体の存在を調べる方法を提供する。]
[0016] 関連する態様において、本発明は、
（ａ）関心のある検体の存在について試験しようとする試料を提供し；
（ｂ）関心のある検体に対する親和性を有するインタラクタードメインを含む、精製された第一のレポーター断片対メンバーを提供し；
（ｃ）関心のある検体に対する親和性を有するインタラクタードメインを含み、関心のある検体との第一及び第二のレポーター断片対メンバーのインタラクタードメインの親和性を通じた第一のレポーター断片対メンバーとの会合時に活性酵素を再構成することにおいて操作可能である、精製された第二のレポーター断片対メンバーを提供し；
（ｄ）基質における再構成活性酵素の作用を通じてグロー発光シグナルを生じさせるために（グロー発光シグナルは、試料中での関心のある検体の存在を示す。）、検体とのインタラクタードメインの親和性を通じて、第一及び第二のレポーター断片対メンバーが試料中の関心のある検体存在下で会合することを可能にするインビトロアッセイ条件下で第一及び第二のレポーター断片と試料を接触させる、
段階を含む、試料中での検体の存在についてアッセイする方法を提供する。]
[0017] 好ましい実施形態において、活性酵素は、ルシフェラーゼ、好ましくはウミシイタケルシフェラーゼ又はその誘導体、例えばＣ１２４Ａ突然変異を含むルシフェラーゼなど、である。]
[0018] ある実施形態において、第一及び第二のレポーター断片対メンバーは、配列番号１０において示されるウミシイタケルシフェラーゼアミノ酸配列のアミノ酸残基セリン９１とチロシン９２との間又はグリシン２２９とリジン２３０との間又は別のルシフェラーゼ配列の同等の位置の間の切断点により形成されるルシフェラーゼポリペプチドのα及びω断片である。]
[0019] グロー発光に基づくＦＥＣアッセイの開発において、発明者らは、グロー発光シグナルを改善する一連のアッセイ条件、即ち次のもののうち1以上、も決定した：
（ｉ）ＤＴＴなどの１以上の還元剤、好ましくは約１から約２％ｗ／ｖの総濃度；
（ｉｉ）チオ尿素などの１以上の変性剤、好ましくは約１から約２％ｗ／ｖの総濃度；
（ｉｉｉ）ＣＨＡＰＳなどの１以上の界面活性剤、好ましくは約０．１から約０．２％ｗ／ｖの総濃度；
（ｉｖ）約０．２５から０．５Ｍの塩；及び／又は
（ｖ）緩衝液としてのＴｒｉｓ ＨＣｌ。]
[0020] 発明者らはまた、好ましいルシフェラーゼ基質、即ちセレンテラジン類似体ｆ、ｈ及びｎからなる群から選択されるルシフェラーゼ基質も同定した（図３参照）。] 図３
[0021] 特定の実施形態において、試料は血液又は血清試料などの生体試料である。]
[0022] 第二の態様において、本発明は、
（ａ）関心のある検体に対する親和性を有するインタラクタードメインを含む精製された第一のレポーター断片対メンバーと；
（ｂ）関心のある検体に対する親和性を有するインタラクタードメインを含み、関心のある検体との第一及び第二のレポーター断片対メンバーのインタラクタードメインの親和性を通じた第一のレポーター断片対メンバーとの会合時に酵素活性を再構成することにおいて操作可能である、精製された第二のレポーター断片対メンバーと；
（ｃ）基質における活性酵素の作用を通じてグロー発光シグナルを生成させるために（グロー発光シグナルが、試料中の関心のある検体の存在を示す。）、検体とのインタラクタードメインの親和性を通じて、試料中の関心のある検体の存在下で第一及び第二のレポーター断片対メンバーが会合することを可能にするインビトロアッセイ条件を提供するための試薬と、
を含む、試料中の関心のある検体の存在を調べるために均一インビトロ強制酵素断片再構成アッセイを行うためのキットを提供する。]
[0023] 関連する態様において、本発明は、試料中での関心のある検体、例えば単純ヘルペスウイルス又はＢ型肝炎ウイルスなどの病原体に対する抗体の存在を調べるための、キットの使用を提供する。]
[0024] 発明者らはまた、レポーターポリペプチドの安定性及びそれゆえにグロー発光アッセイ方式により得られる結果を改善する、保存緩衝液も開発した。インビトロアッセイにより生じる問題の１つは、レポーターポリペプチドの濃度が比較的高いことである。特に、全長ウミシイタケルシフェラーゼは、失活しやすく、４℃で０．５ｍｇ／ｍＬ（およそ１０ｎＭ）よりも高い濃度で凝集する傾向があることが知られている（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９７７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６（１）：８５−９１）。発明者らは、１つ又は糖（スクロース及びトレハロースなど）及び／又は１以上の不活性タンパク質（ウシ血清アルブミンなど）の添加により、保存後のレポーターポリペプチド活性の低下を顕著に抑えることを見出した。]
[0025] 従って、第三の態様において、本発明は、（ｉ）約１０ｎＭを超える総濃度の１以上のレポーターポリペプチドと、（ｉｉ）１以上の糖及び／又は１以上の不活性タンパク質と、を含む、アッセイ試薬保存組成物を提供する。]
[0026] 好ましい実施形態において、この１以上のレポーターポリペプチドは、インビトロ強制酵素再構成アッセイのためのルシフェラーゼレポーターポリペプチドである。]
[0027] 好ましくは、この１以上の糖は、スクロース、トレハロース及びそれらの混合物からなる群から選択される。]
[0028] 好ましくは、１以上の不活性タンパク質は、血清アルブミン、ゼラチン及びそれらの混合物からなる群から選択される。]
[0029] 関連する態様において、本発明は、約１０ｎＭを超える総濃度で１以上のレポーターポリペプチドを含むアッセイ試薬保存組成物中で１又はレポーターポリペプチドを安定させるために１以上の糖及び／又は１以上の不活性タンパク質を含む組成物の使用を提供する。]
図面の簡単な説明

[0030] 比色、蛍光及び発光検体シグナル検出範囲の間の比較。
ウミシイタケルシフェラーゼにより触媒される生物発光反応。
発光強度及び反応時間に関して互いに異なるネイティブセレンテラジン合成誘導体（Ａ−Ｈ）。
２つの機能的分割点、Ｓ９１／Ｙ９２（Ａ）及びＧ２２９／Ｋ２３０（Ｂ）の位置を説明するウミシイタケルシフェラーゼモデル構造。
ウミシイタケルシフェラーゼＦＥＣアッセイ及びその基本的成分の概略図。酵素断片、α及びω、は、疾患特異的抗原ペプチド（Ｐ）及びタンパク質Ｇのあるドメインなどの検体結合部分に連結される。検体（疾患特異的抗体）の存在下で、断片は、近接近とならざるを得ず（右）、それにより生物発光反応の触媒を開始する。
この実験で使用されるＦＥＣ断片（ＡびＢ）の概略図。ＲＬｕｃは、ウミシイタケルシフェラーゼα（α青）及びω（ω緑）断片を指す。検体結合部分（赤）、ＰｒｏＧはタンパク質Ｇドメインを指し、Ｐ（Ｐ１及びＰ２）は、それぞれＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対するＨＳＶ型特異的抗原ペプチドを指す。ヒスチジンタグは灰色で示される。酵素断片を検体結合部分に連結させるために、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）リンカーを使用した。
本発明のαタンパク質断片（ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１及びＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ２）の精製。Ａ）ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１アフィニティー精製プロファイル及び純粋なタンパク質のゲル電気泳動、ＭＷ３５，２１４．２２Ｄａ。Ｂ）アフィニティー精製プロファイル及び純粋なＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ２のゲル電気泳動、ＭＷ３８，６０３．９８Ｄａ。「アフィニティー精製された」と表示されたクロマトグラムは、精製酵素断片の実施形態を示す。本発明のその他の断片に対して同様の結果が得られる。
本発明のωタンパク質断片（ＲＬｕｃ＿２３０ωＰｒｏＧ）の精製。Ａ）ＲＬｕｃ＿２３０ωＰｒｏＧアフィニティー精製プロファイル。Ｂ）アフィニティー精製されたＲＬｕｃ＿２３０ωＰｒｏＧのゲルろ過プロファイル及びゲル電気泳動、ＭＷ１８，１４９．５７Ｄａ。「アフィニティー精製された」及び「ゲルろ過プロファイル」と表示されたクロマトグラムは両者とも、精製された酵素断片の実施形態を示す。本発明のその他の断片に対して同様の結果が得られる。
Ｇ２２９／Ｋ２３０（Ｂ）と比較した、Ｓ９１／Ｙ９２（Ａ）におけるＲＬｕｃ断片分割の遂行。
（Ｂ）本発明の最適化５ｘＰＢエンハンサー緩衝液Ｃ（１５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１％ＣＨＡＰＳ、５％チオ尿素及び２５％グリセロール）との（Ａ）市販ウミシイタケルシフェラーゼ５ｘＰｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液（特許組成物）の使用の比較。
ＨＳＶ−１特異的ＩｇＧに対するルシフェラーゼＦＥＣアッセイ。ルシフェラーゼ断片ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１／ＲＬｕｃ＿２３０ωＰｒｏＧを用いて、ＨＳＶ陰性、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２陽性の個体からの５検体の血清試料をアッセイした。カットオフ＝１．１６。感度＝１００％。特異性＝１００％。５名の患者試料の各セットに対する箱ひげプロットとして正規化酵素活性を示す。]
[0031] 配列リストの簡単な説明
配列番号１．ＨＳＶ１のｇＧ１のアミノ酸９２から１４８。]
[0032] 配列番号２．Ｐ１ ｔｒｕｎｃ、ＨＳＶ−１短縮抗原ヌクレオチド配列。]
[0033] 配列番号３．Ｐ１ ｔｒｕｎｃ、ＨＳＶ−１短縮抗原アミノ酸配列。]
[0034] 配列番号４．ＨＶＳ２のｇＧ２のアミノ酸５５１から６４１。]
[0035] 配列番号５．Ｐ２ ｔｒｕｎｃ、ＨＳＶ−２短縮抗原ヌクレオチド配列。]
[0036] 配列番号６．Ｐ２ ｔｒｕｎｃ、ＨＳＶ−２短縮抗原アミノ酸配列。]
[0037] 配列番号７．タンパク質Ｇサブユニットのヌクレオチド配列。]
[0038] 配列番号８．タンパク質Ｇサブユニットのアミノ酸配列。]
[0039] 配列番号９．Ｃ１２４Ａ突然変異を組み込む合成／コドン最適化ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）レポーター酵素のヌクレオチド配列。]
[0040] 配列番号１０．Ｃ１２４Ａ突然変異を組み込む合成／コドン最適化ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）レポーター酵素のアミノ酸配列。]
[0041] 配列番号１１から１８−表２で示されるプライマー。]
[0042] 配列番号１９．Ｒｌｕｃ＿α９１Ｐ１、ウミシイタケルシフェラーゼα断片（Ｓ９１／Ｙ９２で分割）Ｐ１ ｔｒｕｎｃコンストラクトヌクレオチド配列。]
[0043] 配列番号２０．Ｒｌｕｃ＿α９１Ｐ１、ウミシイタケルシフェラーゼα断片（Ｓ９１／Ｙ９２で分割）Ｐ１ ｔｒｕｎｃコンストラクトアミノ酸配列。]
[0044] 配列番号２１．ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１、ウミシイタケルシフェラーゼα断片（Ｇ２２９／Ｋ２３０で分割）Ｐ１ ｔｒｕｎｃコンストラクトヌクレオチド配列。]
[0045] 配列番号２２．ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１、ウミシイタケルシフェラーゼα断片（Ｇ２２９／Ｋ２３０で分割）Ｐ１ ｔｒｕｎｃコンストラクトアミノ酸配列。]
[0046] 配列番号２３．Ｒｌｕｃ＿α９１Ｐ２、ウミシイタケルシフェラーゼα断片（Ｓ９１／Ｙ９２で分割）Ｐ２ ｔｒｕｎｃコンストラクトヌクレオチド配列。]
[0047] 配列番号２４．Ｒｌｕｃ＿α９１Ｐ２、ウミシイタケルシフェラーゼα断片（Ｓ９１／Ｙ９２で分割）Ｐ２ ｔｒｕｎｃコンストラクトアミノ酸配列。]
[0048] 配列番号２５．ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ２、ウミシイタケルシフェラーゼα断片（Ｇ２２９／Ｋ２３０で分割）Ｐ２ ｔｒｕｎｃコンストラクトヌクレオチド配列。]
[0049] 配列番号２６．ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ２、ウミシイタケルシフェラーゼα断片（Ｇ２２９／Ｋ２３０で分割）Ｐ２ ｔｒｕｎｃコンストラクトアミノ酸配列。]
[0050] 配列番号２７．ＲＬｕｃ＿９２ωＰｒｏＧ、ウミシイタケルシフェラーゼω断片（Ｓ９１／Ｙ９２で分割）タンパク質Ｇサブユニットコンストラクトヌクレオチド配列。]
[0051] 配列番号２８．ＲＬｕｃ＿９２ωＰｒｏＧ、ウミシイタケルシフェラーゼω断片（Ｓ９１／Ｙ９２で分割）タンパク質Ｇサブユニットコンストラクトアミノ酸配列。]
[0052] 配列番号２９．ＲＬｕｃ＿２３０ωＰｒｏＧ、ウミシイタケルシフェラーゼω断片（Ｇ２２９／Ｋ２３０で分割）タンパク質Ｇサブユニットコンストラクトヌクレオチド配列。]
[0053] 配列番号３０．ＲＬｕｃ＿２３０ωＰｒｏＧ、ウミシイタケルシフェラーゼω断片（Ｇ２２９／Ｋ２３０で分割）タンパク質Ｇサブユニットコンストラクトアミノ酸配列。]
[0054] 配列番号３１．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ａ５ １本鎖（ｓｃＦｖ）コンストラクトヌクレオチド配列。]
[0055] 配列番号３２．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ａ５ １本鎖（ｓｃＦｖ）コンストラクトアミノ酸配列。]
[0056] 配列番号３３．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ｅ１１ １本鎖（ｓｃＦｖ）コンストラクトヌクレオチド配列。]
[0057] 配列番号３４．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ｅ１１ １本鎖（ｓｃＦｖ）コンストラクトアミノ酸配列。]
[0058] 配列番号３５．ＲＬｕｃ＿α９１Ａ５、ウミシイタケルシフェラーゼω断片（Ｓ９１／Ｙ９２で分割）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）Ａ５ １本鎖（ｓｃＦｖ）コンストラクトヌクレオチド配列。]
[0059] 配列番号３６．ＲＬｕｃ＿α９１Ａ５、ウミシイタケルシフェラーゼω断片（Ｓ９１／Ｙ９２で分割）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ａ５ １本鎖（ｓｃＦｖ）コンストラクトアミノ酸配列。]
[0060] 配列番号３７．ＲＬｕｃ＿９２ωＥ１１、ウミシイタケルシフェラーゼω断片（Ｓ９１／Ｙ９２で分割）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ｅ１１ １本鎖（ｓｃＦｖ）コンストラクトヌクレオチド配列。]
[0061] 配列番号３８．ＲＬｕｃ＿９２ωＥ１１、ウミシイタケルシフェラーゼω断片（Ｓ９１／Ｙ９２で分割）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ｅ１１ １本鎖（ｓｃＦｖ）コンストラクトアミノ酸配列。]
[0062] 別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、（例えば、細胞生物学、化学及び分子生物学において）当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子及び生化学の方法に対して使用される標準的技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙという題名の完全版で見出すことができる。]
[0063] 特定の実施形態及び実施例の次の詳細な説明は、説明のために与えられるのであり、限定のためではない。禁忌でないか又は別段の断りがない限り、これらの記述において、及びこの明細書を通じて、「ａ」及び「ａｎ」という語は、１以上を意味する。同様に、「又は」とは「及び／又は」を意味する。]
[0064] 「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、以下に限定されないが、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語に続くもの全てを含むものとする。従って、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の使用は、列挙される要素が必要とされるか又は必須であるが、その他の要素が任意であり、存在してもしなくてもよいことを指す。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句に続くもの全てを含み、それらに限定されるものとする。従って、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句は、列挙される要素が必要とされるか又は必須であり、その他の要素が全く存在し得ないことを指す。「基本的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、この句の後に列挙されるあらゆる要素を含み、列挙される要素に対する開示で特定される活性及び作用を妨害しないか又は関与しないその他の要素に限定されることを指す。従って、「基本的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という句は、列挙される要素が必要とされるか又は必須であるが、その他の要素が任意であり、それらが列挙される要素の活性又は作用に影響するか否かに依存して存在しても存在しなくてもよいことを示す。]
[0065] 一連の値が与えられる場合、文脈から明らかに指示されない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各中間値及び、指示範囲の何らかのその他の指示される値又は中間にある値が、本発明内に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立に、より小さい範囲に含まれ得、また、本発明内に包含され、指示される範囲における何らかの具体的に除外される制限に従う。]
[0066] レポーター成分及びレポーターポリペプチド断片
本発明のアッセイ法は、均一インビトロＦＥＣアッセイの単離され精製された成分としての使用のために適応されるポリペプチドを含むか又はそれらからなるレポーター成分を使用する。このレポーター成分は、レポーター系の一部をなす。上述のように、ＦＥＣアッセイにおけるレポータ系は、それらが会合する場合に、検出可能なシグナルを生成させることができるレポータータンパク質複合体を形成する２以上のポリペプチド断片を含む。従って、各レポーター成分は、少なくとも１つのこのようなポリペプチド断片又はサブユニット（本明細書中で「レポーター断片」と呼ぶ。）を含む。従って、２つのレポーター成分がアッセイ条件下で会合した場合に、結果として得られる複合体がルシフェラーゼ活性を有するように、ルシフェラーゼ活性に基づく系に対して、第一のレポーター成分は、ルシフェラーゼなどの酵素のα断片を含み得、第二のレポーター成分は、ルシフェラーゼなどの酵素のω断片を含み得る。それらの個々のレポーターポリペプチド断片（「サブユニット」とも呼ばれる。）が会合させられる場合に一緒になって検出可能な酵素活性を生じさせ得る第一のレポーター成分及び第二のレポーター成分の組み合わせは、本明細書中で「レポーター成分対」と呼び、個々のレポーターポリペプチド断片はまとめて「レポーター断片対」と呼ぶ。]
[0067] いくつかのルシフェラーゼが分割され、Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（２４）：１５６０８−１５６１３及びＰａｕｌｍｕｒｕｇａｎら、２００７、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７９（６）：２３４６−２３５３におけるホタル、フォチナス・フィラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ、Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎら、２００３、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５（７）：１５８４−１５８９及びＫａｉｈａｒａら、２００３、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５（１６）：４１７６−４１８１におけるウミシイタケ、レニラ・レミフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｍｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ及びＲｅｍｙら、２００６、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３（１２）：９７７−９９９における海洋コペポーダ（ｍａｒｉｎｅ ｃｏｐｅｐｏｄ）、ガウシア・プリンセプス（Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ）ルシフェラーゼを含め、ＦＥＣを介してタンパク質−タンパク質相互作用を調べるために首尾よく使用されてきた。野生型タンパク質に加えて、放射光の波長を変更するために（例えば赤にシフトしたルシフェラーゼを記載する米国特許第６，４９５，３５５号）及び／又はインビトロでの特性を改善するために、多くのルシフェラーゼが修飾されてきた。ルシフェラーゼ変異体は本発明の範囲内である。]
[0068] 商業化及び製造に適したインビトロ均一アッセイを作製する目的に対して、ルシフェラーゼ安定性、大きさ及び基質利用などの事項（表１）は、具体的ルシフェラーゼの選択に関連する。セレンテラジンの酸化を介した光の生成に関与するレニラ・レミフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｍｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ（ＥＣ１．１３．１２．５）（図２）は、小さく（３６ｋＤａ）、単量体であり、含有するシステインは３個のみ（これらの中にジスルフィド結合を形成するものはない。）なので、特にＦＥＣ方式への適用に適切である（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９７７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６（１）：８５−９１）。さらに、位置１２４のシステインのアラニンへの突然変異によって安定性を向上させることができる（Ｌｉｕら、１９９９、Ｇｅｎｅ ２３７：１５３−１５９）。それらの光強度及び反応時間が異なるセレンテラジンの類似体と組み合わせて使用される場合（図３）、いくつかの補足的突然変異の使用により、ウミシイタケルシフェラーゼ安定性及び光出力をさらに改善することができる（Ｌｏｅｎｉｎｇら、２００６、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１９（９）：３９１−４００及びＬｏｅｎｉｎｇら、２００７．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４（８）：６４１−６４３）。] 図２ 図３
[0069] ]
[0070] 既に記載されるような分割生物発光レポーター酵素の使用に対する代替的ストラテジーは、グロー発光が生成され得る、合成された発光基質又はプロ発光基質、例えばプロルシフェリン（Ｆａｎ及びＷｏｏｄ、２００７、Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５（１）：１２７−１３６）と旧来的に化学発光反応を触媒しない分割レポーター酵素を組み合わせることによる、旧来的に化学発光反応を触媒しない分割レポーター酵素の使用である。いくつかの特許は、発光β−ラクタマーゼ基質、例えば、米国特許第５，９５５，６０４号、同第７，０１８，８０２Ｂ２号及び米国特許出願公開第２００６０２９２６５６Ａ１で開示されているものの合成及び使用を開示する。最近、「Ｂｌｕｃｏ」と呼ばれるβ−ラクタマーゼに対する最初の生物発光性基質が、Ｙａｏら、２００７、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４６：１−５で文献に記載された。Ｂｌｕｃｏは、Ｄ−ルシフェリンの６−ヒドロキシ基がエーテル結合を通じてセファロスポリンとカップリングされるプロ−ルシフェリンである。β−ラクタマーゼは、β−ラクタム環を開環させるように作用し、その結果、自然発生的に断片化が起こり、それにより続いてホタルルシフェラーゼがルシフェリンにおいて作用できるようになり、結果として光放射が起こる。]
[0071] 従って、本発明のアッセイ法は、ルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質に基づくレポーターポリペプチドに限定されず、また、本明細書中で発光レポーターポリペプチドと呼ばれる適切な基質の存在下で発光シグナルを生成させ得る何らかのレポーターポリペプチドの使用も含む。従って、レポーター断片及び系に対する基礎として使用され得るレポーターポリペプチドの例には、ルシフェラーゼ（例えばホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ）及びβ−ラクタマーゼ（例えばＴＥＭ−Ｉβ−ラクタマーゼ：ＥＣ：３．５．２．６）などの生物発光タンパク質が含まれる。]
[0072] 上述のように、レポーターポリペプチドは、通常、それらが会合する際に元の全長ポリペプチドの活性を再構築することができる２つの断片に分割される。例えば、ルシフェラーゼ及びβ−ラクタマーゼは、通常、２つの断片、α及びω断片に分割される。２つの断片を生成させるためのこれらの様々なタンパク質のアミノ酸配列における適切な切断点は、既に記載されている。]
[0073] レポーターポリペプチド／断片は、それらがインビトロでの使用に適切であるように選択される（疑義を避けるため、本文脈において、インビトロという用語は、生きている細胞の外側でアッセイが行われることを意味する。）。このレポーターポリペプチドは、通常、例えば安定性を促進し、可溶性を向上させ及び／又は凝集を減少させるためにインビトロの使用のためのそれらの適切性を向上させるアミノ酸の変化がある野生型配列の変異体である。特に好ましい実施形態において、このレポーターポリペプチド／断片は、レポーター機能に必要とされるポリペプチドの活性、例えばβラクタマーゼ活性の酵素阻害剤などの阻害剤に対して、野生型ポリペプチドと比較して、感度が低い。このような阻害剤には、関心のある検体の存在について試験することが望ましい試料、例えば血液及び血清試料などの生体試料中で見出される化合物が含まれる。このような阻害剤の特定例は、血液試料が採取される個体への抗生物質の投与の結果として血液中で見出されるβ−ラクタマーゼ活性の阻害剤である。]
[0074] アッセイ条件下で、レポーター活性を有する活性複合体を形成するためのレポーター断片の会合には、通常、レポーター成分のその他の領域と標的検体との間の相互作用が介在する。従って、レポーター成分は、通常、インタラクター部分又はドメインを含む。]
[0075] インタラクタードメインは、関心のある標的検体に対して結合特異性を有する。インタラクタードメインには、例えば、ペプチド、糖タンパク質、多糖類、抗原、抗体及び抗体の抗原結合断片（相補性決定領域（ＣＤＲ）など）が含まれる。抗原には、ウイルス又は細菌抗原などの病原体由来の抗原が含まれる。抗体／ＣＤＲには、ウイルス又は細菌などの病原体由来の抗原に結合する配列が含まれる。インタラクタードメインの特定の例には、タンパク質ＧのＩｇＧ結合ドメイン及び単純ヘルペスウイルス抗原（特に好ましいのは、ＨＳＶ１からの短縮糖タンパク質Ｇ１エンベロープタンパク質又はＨＳＶ２からの短縮糖タンパク質Ｇ２エンベロープタンパク質であるもの、ｇＧ１のアミノ酸９２から１４８又はｇＧ２の５５１から６４１など）が含まれる。]
[0076] インタラクタードメインは、レポーター断片に直接連結され得るか又はリンカーを介して連結される。適切なリンカードメインには、グリシンリッチ反復配列（例えばＧ４Ｓ反復配列−即ちＧＧＧＧＳ配列反復）などのペプチドが含まれる。リンカードメイン、例えばＧ４Ｓドメインの数は、１、２、３、４、５、６以上であり得る。ある実施形態において、グリシンリッチ反復配列の数は好ましくは２又は３であり、特にインタラクタードメインは、１５０又は１００アミノ酸より少ないポリペプチドである。より大きいインタラクタードメインが使用される場合、リンカーの長さを延長することが所望され得る。]
[0077] ある実施形態において、リンカードメインは柔軟である。別の実施形態において、リンカードメインは柔軟性がない。]
[0078] 何らかの特定のインタラクター及びレポーター断片コンストラクト及び断片対形成に対する適切なリンカードメイン配列及び／又はリンカードメイン反復数の選択は、当業者による通常の実験レベルの範囲内である。]
[0079] レポーター断片ポリペプチド、リンカードメイン及びインタラクタードメインは、レポーター成分を形成するための共有又は非共有手段により連結され得る。]
[0080] ある実施形態において、リンカードメイン及びインタラクタードメインは、ポリペプチドである。従って、レポーター成分は１個のポリペプチドであり得る。]
[0081] 別の実施形態において、レポーター断片は、共役させること、例えばチオール−チオール、アミン−カルボキシル又はアミン−アルデヒド官能基を介した、例えば共有カップリングによって、インタラクタードメインと連結される。特定の例には、炭水化物基を介した糖タンパク質へのポリペプチドの架橋；例えばヘテロ二官能性クロスリンカーを用いた、アミン反応基及びスルフィドリル反応基との、一級アミン（Ｎ末端及びリジン残基で見られる。）を介した架橋；カルボキシル基を介した架橋（Ｃ末端及びグルタミン酸及びアスパラギン酸残基の側鎖として見出される。）；遊離スルフィドリル基を介した架橋；及びジスルフィド変換が含まれる。]
[0082] 非共有法には、アビジン−ビオチン系及びオリゴヌクレオチド−タンパク質複合体のハイブリッド形成が含まれる。]
[0083] 本明細書中で使用される場合、ペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、実質的に細胞性物質不含であるか又は化学的前駆体もしくはその他の化学物質不含である場合、「単離」又は「精製」されていると言われる。このペプチドは、均一になるまで又はその他の純度まで精製され得る。精製レベルは目的の用途に基づく。本発明における目的の用途は、特異的検体に対する均一なインビトロＦＥＣアッセイの操作可能な成分として、である。]
[0084] ある使用において、「実質的に細胞性物質不含」には、その他のタンパク質（即ち夾雑タンパク質）が約３０％未満（乾燥重量）であるか、その他のタンパク質が約２０％未満であるか、その他のタンパク質が約１０％未満であるか又はその他のタンパク質が約５％未満である、ペプチドの調製物が含まれる。このペプチドが組み換え産生される場合、これは実質的に培地不含でもあり得、即ち、培地がタンパク質調製物体積の約２０％未満であるということである。]
[0085] 「実質的に化学前駆体又はその他の化学物質不含」という語は、化学前駆体又はその合成に関与するその他の化学物質からペプチドが分離される、ペプチドの調製物を含む。ある実施形態において、「実質的に化学前駆体又はその他の化学物質不含」という語は、化学前駆体もしくはその他の化学物質が約３０％（乾燥重量）未満であるか、化学前駆体もしくはその他の化学物質が約２０％未満であるか、化学前駆体もしくはその他の化学物質が約１０％未満であるか又は化学前駆体もしくはその他の化学物質が約５％未満である、酵素ペプチドの調製物を含む。]
[0086] 単離されたレポーター断片及びポリペプチドレポーター成分は、それを発現させるために改変されている細胞から精製され得るか（組み換え）又は既知のタンパク質合成法を用いて合成され得る。例えば、酵素ペプチドをコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングし、その発現ベクターを宿主細胞に導入して、その宿主細胞中でタンパク質を発現させる。適切な宿主細胞を下記でより詳細に述べる。次に、適切なタンパク質精製技術を用いて適切な精製スキームにより、細胞からこのタンパク質を単離し得る。本発明の例示的な技術は、下記で記す実施例で詳細に述べる。]
[0087] ある態様において、レポーターポリペプチドは、本明細書中で提供されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。あるアミノ酸配列があるタンパク質の最終アミノ酸配列である場合、このタンパク質はそのアミノ酸配列からなる。さらなる態様において、本発明は、基本的に提供されるアミノ酸配列からなるタンパク質をさらに提供する。本発明のタンパク質の機能的特性を変更しないわずか数個のさらなるアミノ酸残基とともにアミノ酸配列が存在する場合、タンパク質は、基本的にそのアミノ酸配列からなる。またさらなる態様において、レポーターポリペプチドは、提供されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。あるアミノ酸配列があるタンパク質の最終アミノ酸配列の少なくとも一部である場合、このタンパク質はそのアミノ酸配列を含む。このような方式において、このタンパク質は、単にペプチドであり得るか又は、それと会合されるアミノ酸残基（隣接するコードされる配列）又は異種アミノ酸残基もしくはペプチド配列などのさらなるアミノ酸分子を有し得る。このようなタンパク質は、数個のさらなるアミノ酸残基を有し得るか又は数百以上のさらなるアミノ酸を含み得る。様々なタイプのこれらのタンパク質がどのように作製され得るか又は単離され得るかについての簡潔な説明を下記で与える。]
[0088] 本発明で使用されるレポーターポリペプチドは、キメラ又は融合タンパク質を形成するために異種配列と連結され得る。このようなキメラ及び融合タンパク質は、酵素ペプチドと実質的に相同ではないアミノ酸配列を有する異種タンパク質と操作可能に連結される酵素ペプチドを含み得る。「操作可能に連結される」とは、それぞれの操作可能性が破壊されないように、酵素ペプチド及び異種タンパク質が融合されることを指す。異種タンパク質は、酵素ペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合され得る。]
[0089] キメラ又は融合タンパク質は、標準的組み換えＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、様々なタンパク質配列をコードするＤＮＡ断片は、従来技術に従い、インフレームで一緒に結合される。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成装置を含む従来技術により合成され得る。あるいは、キメラ遺伝子配列を作製するために、続いてアニーリングを行い、再増幅され得る２つの連続的な遺伝子断片の間で相補的突出を生じさせるアンカープライマーを用いて、遺伝子断片のＰＣＲ増幅又は結合（ライゲーション）を行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９８参照。）。さらに、融合部分を既にコードする多くの発現ベクターが市販されている。酵素ペプチドをコードする核酸は、融合部分がインフレームで酵素ペプチドに連結されるように、このような発現ベクターにクローニングされ得る（これは、各成分の操作可能を破壊することなく融合タンパク質を作製する１つの手段である。）。]
[0090] 代替的配列付番スキームにおける相同位置の識別
２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列の比較において相同である位置を調べるために、最適比較のために配列を整列させる（例えば、最適アラインメントに対して第一及び第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列の一方又は両方にギャップが導入され得、非相同配列は比較に対して無視され得る。）。好ましい実施において、参照配列の長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上を比較のために整列させる。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一の配列での位置に、第二の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドがある場合、その分子はその位置において同一であり、その位置はこの２つにおいて相同である。２つの配列の間の％同一性は、ギャップ数及び各ギャップの長さを考慮した（この２つの配列の最適アラインメントに対して導入される必要がある。）、これらの配列が共有する同一位置の数の関数である。]
[0091] 配列の比較及び２つの配列間の％同一性及び類似性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて遂行し得る（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）。]
[0092] 例えば、ペアワイズアラインメント及び配列同一性及び相同性のレベルは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＢｅｓｔＦｉｔプログラムを用いて決定され得る。２つのアミノ酸配列間の％同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを用いて決定され得る。このアルゴリズムは通常、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスの何れか及び１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップウェイト（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）及び１、２、３、４、５又は６のレンスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）とともに使用される。２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、ＮＳＷｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクス及び４０、５０、６０、７０又は８０のギャップウェイト（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）及び１、２、３、４、５又は６のレンスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）で、ＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））を用いて決定され得る。]
[0093] 従って、アミノ酸配列又はペプチドのある位置での置換は、アミノ酸に対する一文字表記とそれに続く関連性のある非置換配列又はペプチドの位置番号、それに続く置換アミノ酸に対する１以上の一文字表記で示される。例えば、ＴＥＭ−Ｉβ−ラクタマーゼのα断片の位置７４のバリンに対するスレオニンの置換は、Ｖ７４Ｔと表記される。類似の表記は、本明細書中で提供される内容及びさらなる詳細から明らかとなろう。]
[0094] インビトロでのレポーター機能を向上させるためのアミノ酸修飾
本発明のアッセイでの使用のためのレポーターポリペプチド断片は、このようなアッセイでの使用のためのレポーターポリペプチドの適切性を向上させるアミノ酸配列変化又は修飾を含み得る。特に、好ましい実施形態において、レポーターポリペプチド断片の少なくとも１つは、再構成される活性レポーターポリペプチド複合体が、非修飾（例えば野生型）アミノ酸配列の阻害剤、特に血清を含む生体試料などの、試験しようとする試料において見出される物質である物質による阻害を受けにくくする、そのアミノ酸配列における変異又はそのアミノ酸配列に対する修飾を含む。]
[0095] このような変異体は通常、重要な残基又は重要な領域における１以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、逆転もしくは短縮又は置換、挿入、逆転又は欠失を含有する。機能が変化した変異体はまた、機能を変化させないか又は僅かな変化しか起こさない、類似アミノ酸の置換も含有し得る。ある実施形態において、変異体は、１、２、３、４又は５個のアミノ酸変化を含有する。]
[0096] 発明者らの同時係属出願ＰＣＴ／ＡＵ２００７／０００５０８（この内容は参照により組み込まれる。）は、１個のアミノ酸置換又は、本明細書中でさらに例示されるような均一インビトロＦＥＣアッセイでの使用に特に適合される組み合わせの複数の置換を含む修飾β−ラクタマーゼペプチド配列を記載する。このような置換の具体例は、α断片のアミノ酸位置６９での置換（好ましくはＭ６９Ｌ又はＭ６９Ｉ）（これによりβ−ラクタマーゼ阻害剤による阻害が抑制される。）及びω断片のアミノ酸位置２７６での置換（好ましくはＮ２７６Ｄ）（これによってもまた、β−ラクタマーゼ阻害剤による阻害が抑制される。）である。その他の例は、アミノ酸位置７４、１８２、２０８、２１１及び２３０の１以上（Ｖ７４Ｔ、Ｍ１８２Ｔ、Ｉ２０８Ｔ、Ｍ２１１Ｑ及びＦ２３０Ｙの好ましくは１以上）での置換から選択される。]
[0097] さらなる例は、アッセイを改善させ得る疎水性が低いと考えられる何らかの残基に対する次の疎水性アミノ酸残基の突然変異である：Ｖ４４、Ｙ４６、Ｌ４９、Ｌ５１、Ｆ６６、Ｖ７４、Ｌ８１、Ｆ１５１、Ｐ１８３、Ｖ１８４、Ａ１８７、Ｌ１９０、Ｌ１９４、Ｌ１９８、Ｌ１９９、Ｌ２０７、Ｉ２０８、Ｗ２１０、Ｍ２１１、Ａ２３２、Ｉ２４７、Ａ２４９、Ｐ２５７、Ｉ２６０、Ｉ２６１、Ｉ２６２、Ｉ２６３、Ｙ２６４、Ｉ２８２、Ｌ２８６（特に太字及び下線付きの残基）。]
[0098] 与えられるアミノ酸付番は、ＰＣＴ／ＡＵ２００７／０００５０８の配列番号１及び３で示される野生型ＴＥＭ−１βラクタマーゼ配列を基準にする。しかし、当然のことながら、同等の位置で相同βラクタマーゼ配列にも修飾が適用され得る（配列アラインメントによる同等位置の決定に対する前記セクション参照）。]
[0099] 上述のように、位置１２４のシステインのアラニンへの突然変異により、ウミシイタケルシフェラーゼ安定性及び光出力に対して、安定性を向上させることができる（Ｌｉｕら、１９９９、Ｇｅｎｅ ２３７：１５３−１５９）。光強度及び反応時間の点で異なるセレンテラジンの類似体と組み合わせて使用される場合、いくつかの補助的突然変異の使用により、ウミシイタケルシフェラーゼ安定性及び光出力に対してさらなる改善を行うことができる（Ｌｏｅｎｉｎｇら、２００６、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１９（９）：３９１−４００及びＬｏｅｎｉｎｇら、２００７、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４（８）：６４１−６４３）（図３）。] 図３
[0100] 均一アッセイなど、インビトロアッセイでの使用に対する特性が向上した修飾レポーター断片は、様々な技術を用いて得ることができる。例えば、部位特異的突然変異誘発によって配列変化を導入し得る。適切な部位の選択は、例えば、Ｘ線結晶解析又はＮＭＲなどの技術により調べられる構造情報を含んだ一次アミノ酸配列及び／又は二次／三次構造情報により判断され得る。例えば、阻害を受けにくくなっている変異体の設計を支援するために、酵素の活性部位の３Ｄ構造を使用することができる（例えば、Ｊｅｌｓｃｈ、Ｃ．Ｆ．Ｌｅｎｆａｎｔら、１９９２、ＦＥＢＳＬｅｔｔ ２９９（２）：１３５−４２に記載のようなＴＥＭ１の結晶構造参照）。]
[0101] 特性が改善された修飾レポーター断片はまた、無作為突然変異誘発又は定方向分子進化などの技術及び続く所望の特性を有する変異体の選択によっても得ることができる（例えば、未修飾タンパク質の阻害剤の存在下で酵素活性について変異体を試験することによる。）。]
[0102] 本発明において有用なさらなる修飾には、２０種天然アミノ酸と一般に呼ばれる２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸を含有する配列が含まれ得る。さらなる修飾には、以下に限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、結晶化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などのタンパク質に対するアミノ酸のトランスファーＲＮＡ介在付加及びユビキチン化が含まれる。]
[0103] 従って、本発明での使用のためのペプチド及びコンストラクトはまた、置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によりコードされるものではなく、置換基が含まれ、成熟酵素ペプチドが、酵素ペプチドの半減期を延長させるための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）などの別の化合物と融合されるか、又は、リーダーもしくは分泌配列又は成熟酵素ペプチドの精製のための配列又はプロタンパク質配列など、さらなるアミノ酸が成熟酵素ペプチドに融合される、誘導体又は類似体も包含する。]
[0104] グロー発光インビトロＦＥＣアッセイ
本発明は、検体の有無がグロー発光シグナルを検出することにより測定される、試料中の関心のある検体を検出するためのインビトロＦＥＣアッセイに関する。]
[0105] 本方法は、一般に、上述のように、試料中の関心のある検体の存在下で酵素活性を再構成することができる発光レポーター成分と試料を接触させることを含み、ここで、酵素活性は、発光シグナルを生成させるために、反応混合物中に存在する適切な基質において作用し得る。従って、関心のある検体が試料中に存在する場合、反応混合物中で基質において作用する活性酵素が生成し発光シグナルが生成される。次にこのシグナルを検出する。]
[0106] 本明細書中に記載のように、インビトロアッセイ条件は、生成されるシグナルが、フラッシュ発光ではなくグロー発光を含むようなものである。使用されるアッセイ条件は、検出可能なグロー発光シグナルに加えて、フラッシュ発光シグナルが生成される可能性を必ずしも排除する必要はなく、ある実施形態においては、関心のある検体の存在下で両タイプのシグナルが生成され得る。]
[0107] 関心のある検体には、環境又は生体試料中に存在するものが含まれる。生体試料には、全血、血清、唾液及び尿が含まれる。「インビトロ」という用語は、本状況において、細胞不含アッセイなど、生きている細胞の外側でアッセイが行われることを意味するものとする。関心のある検体には、病原体に対する抗体などの抗体、病原体由来の抗原などの抗原、ホルモンなどの臨床マーカー及び宿主分子、例えば前立腺特異的抗原及びその他の疾患関連診断マーカー分子が含まれる。「病原体」という用語には、ウイルス、細菌及びプリオンが含まれる（例えば単純ヘルペスウイルス及び肝炎ウイルス、例えばＨＢＶ及びＨＣＶなど）。]
[0108] 適切な発光レポーター成分を上記で詳細に記載する。使用される基質は、関心のある検体の存在下で発光レポーター成分の会合により再構成される酵素活性のタイプに依存し、基質における再構成酵素の作用が発光シグナルを生じさせるように選択される。例えば、ウミシイタケなどの生体由来ルシフェラーゼの場合、基質は、通常、セレンテラジン又はその類似体、例えば図３で示される類似体の１つなどであり、セレンテラジン類似体ｆ、ｈ及びｎが特に好ましい。ホタルルシフェラーゼの場合、基質は通常、ルシフェリン又はその類似体である。] 図３
[0109] 適切な化学発光基質はまた、例えばプロ−ルシフェリンなど、β−ラクタマーゼなどの非生物発光酵素に対しても設計され得る（Ｆａｎ及びＷｏｏｄ、２００７、Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５（１）：１２７−１３６）。いくつかの特許は、例えば米国特許第５，９５５，６０４号、同第７，０１８，８０２号及び米国特許出願公開第２００６０２９２６５６で開示されるものなど、発光β−ラクタマーゼ基質の合成及び使用を開示する。最近、Ｙａｏら、２００７、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４６：１−５の文献において、「Ｂｌｕｃｏ」と呼ばれるβ−ラクタマーゼに対する最初の生物発光性基質が記載された。Ｂｌｕｃｏは、Ｄ−ルシフェリンの６−ヒドロキシ基がエーテル結合を通じてセファロスポリンにカップリングされるプロ−ルシフェリンであり、β−ラクタマーゼはβ−ラクタム環を開環するように作用し、その結果、自然な断片化が起こり、続いてホタルルシフェラーゼがルシフェリンにおいて作用することができるようになり、その結果、光が放射される。]
[0110] インビトロアッセイのために必要とされるレポーター成分の量は、一般に、インビボで見られるものよりも高い。例えば、反応混合物中のポリペプチドなどのレポーター成分の濃度は、少なくとも１ｐＭ、例えば少なくとも１０もしくは１００ｐＭ又は１もしくは１０ｎＭなどであり得る。]
[0111] グロー発光に基づくＦＥＣアッセイの開発において、発明者らは、グロー発光シグナルを増強する一連のアッセイ条件を決定した。これらのアッセイ条件には、次の１以上の存在及びその何らかの組み合わせ、特に（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が含まれる：
（ｉ）還元剤：増強グロー発光シグナルの生成のために１又は還元剤を含むことが重要であることが分かった。本明細書中で指示される場合、還元剤は、タンパク質ジスルフィド結合において可逆的に作用し得、従って、チオール還元剤、例えばＤＴＴ及び関連化合物ならびに２−メルカプトエタノール及び関連化合物及びホスフィン及び関連化合物などを含む。還元剤の好ましい総濃度は約１から約２％ｗ／ｖである。しかし、最適濃度は、ある種の系に対して実験的に、例えば実施例に記載の手順を用いて、決定され得る。]
[0112] （ｉｉ）変性剤：１以上の変性剤は、好ましくは、互いに対するレポーター酵素断片の自然な親和性（自然発生的な相補性）を低下させるために含まれる。変性剤には、尿素、チオ尿素及びグアニジン塩酸塩が含まれ、チオ尿素が特に好ましい。変性剤の総濃度は、約１から約２％ｗ／ｖ、例えば約１．３から約１．６ｗ／ｖであり得る。しかし、繰り返すが、最適濃度は、ある種の系に対して実験的に、例えば実施例に記載の手順を用いて、決定され得る。]
[0113] （ｉｉｉ）界面活性剤：タンパク質−タンパク質相互作用、特にレポーター断片の自己会合を減少させるために、好ましくは１以上の界面活性剤が含まれる。好ましい界面活性剤は、好ましくは約０．１から約０．２％ｗ／ｖの総濃度の、アミノスルホベタイン−１４，３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、［（３−［３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）及び塩酸のその他のスルホベタイン誘導体などの非変性両性イオン界面活性剤である。繰り返すが、最適濃度は、ある種の系に対して実験的に、例えば実施例に記載の手順を用いて、決定され得る。]
[0114] （ｉｖ）塩：これは、好ましくは約０．２５Ｍから０．５Ｍの濃度で含まれる。ＮａＣｌは、好ましい例であるが、その他の塩を使用し得る。最適濃度は、ある種の系に対して実験的に、例えば実施例に記載の手順を用いて、決定され得る。]
[0115] （ｖ）緩衝液としてのＴｒｉｓ ＨＣｌ。これにより、リン酸ナトリウム又はカリウム緩衝液と比較して結果が改善されることが示された。使用されるＴｒｉｓ ＨＣｌの濃度は、通常、約２０ｍＭから約２００ｍＭの範囲、例えば約５０ｍＭなどである。反応混合物のｐＨは、好ましくは、約６．５から約８．０、例えば約６．８から約７．５である。最適濃度及びｐＨは、ある種の系に対して実験的に、例えば実施例に記載の手順を用いて、決定され得る。]
[0116] （ｖｉ）金属キレート剤：ＥＤＴＡ及びその変異体などの１以上の金属キレート剤、例えばＥＧＴＡ。これは、血液試料などの試験しようとする試料が金属イオンを含む場合、特に適切である。通常、金属キレート剤の総濃度は、約１ｍＭから１０ｍＭ、例えば７ｍＭから９ｍＭ、例えば約５ｍＭである。最適濃度は、ある種の系に対して実験的に、例えば実施例に記載の手順を用いて、決定され得る。]
[0117] 照度計など、当業者にとって公知の方法を用いて、関心のある検体が存在する結果起こる光放射を検出することができる。]
[0118] 上記の様々なアッセイ条件は、好ましくは、関心のある検体の存在下で、少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも１０分間、グロー発光の発光時間が延長されるように選択される。]
[0119] 光放射の速度は、因子の中でも、積分時間、断片濃度及び基質濃度に関連する。しかし、好ましい光放射速度は、速度論的定量に対して、２、５、１０、２０又は５０ｍＲＬＵ／分より大きいなど、１ｍＲＬＵ／分より大きく；エンドポイント定量に対して、２、５又は１０ＲＬＵより大きいなど、１ＲＬＵより大きい。好ましいシグナル対ノイズ比は、速度論的定量及びエンドポイント検出方式の両方に対して２より大きく、例えば５又は１０より大きい。]
[0120] 本発明の方法は、インビトロ均一アッセイ及びインビトロ不均一アッセイの両方に適用され得、後者は、少なくとも１つのレポーター断片又はレポーター成分が固相に固定化される場合である。]
[0121] ある実施形態において、例えばマイクロタイタープレートの異なるウェルにおいて、複数の反応容器中で、平行して、本アッセイを行う。例えば、実質的に同時に、少なくとも６個のウェルで、例えば少なくとも１０又は１２個のウェルなどで、アッセイを行い得る。長時間発光型グロー発光シグナルの生成により、シグナルが減衰する前に、全てのウェルで発光シグナル読み取り能が向上する。]
[0122] ある実施形態において、個別の発光シグナル、例えば二重グローシグナル（ホタルルシフェラーゼにより生じるグローシグナル及びウミシイタケルシフェラーゼにより生じるグローシグナルなど）を生成させる様々なレポーター成分を用いて同じ反応において複数の検体を検出する。１つの試料内での２つの独立する検体の同時検出は、多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）として知られている。代替的な実施形態において、様々なレポーター成分（このうち少なくとも１つは長時間発光型グロー発光シグナルを生成させ得、少なくとも１つは比色シグナルなどの非発光シグナルを生成させ得る。）を用いて、同じ反応において複数の検体を検出する。]
[0123] キット
本発明ははまた、関心のある検体の存在下でのグロー発光シグナルの生成に必要なその他のキット成分と一緒に、キットとしてレポーター断片及び／又はレポーター成分も提供する。このようなキットには、基質において結果として得られる活性酵素の作用を通じてグロー発光シグナルを生成させるために、試料中の関心のある検体の存在下で、検体とのレポーター成分のインタラクタードメインの親和性を通じてレポーター成分が会合できるようにするインビトロアッセイ条件を提供するための試薬と一緒に、上述のレポーター成分が含まれる。この試薬には、上記の項目（ｉ）から（ｖｉ）で記載される様々な成分の１以上が含まれる。ある実施形態において、使用前に希釈される濃縮反応緩衝液、例えば２ｘから２０ｘ濃縮液、例えば５ｘから１０ｘ濃縮液など、として試薬が提供される。]
[0124] アッセイ試薬保存組成物
本発明の別の態様は、タンパク性のレポーター成分の保存の改善に関する。特に、本発明は、（ｉ）約１０ｎＭより高い総濃度の１以上のレポーターポリペプチド及び（ｉｉ）１以上の糖及び／又は１以上の不活性タンパク質を含むアッセイ試薬保存組成物を提供する。糖及び／又は不活性タンパク質は、保存中（例えば約４℃）にレポーターポリペプチドの半減期を安定化／延長するために、及び場合によってはまたレポーターポリペプチド凝集を減少させるためにも使用される。]
[0125] 本発明の保存組成物との関連で、レポーターポリペプチドには、上述のような発光レポーターポリペプチド及びレポーターポリペプチドのその他のタイプの両方が含まれる。好ましい実施形態において、少なくとも１つのレポーターポリペプチド又はレポーターポリペプチド対は、インビトロ強制酵素再構成アッセイに対するルシフェラーゼレポーターポリペプチなどの発光レポーターポリペプチドである。特定の実施形態において、ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼである。]
[0126] １以上のレポーターポリペプチドは、約２０、３０、４０又は５０ｎＭを超えるなど、約１０ｎＭより高い総濃度で組成物中に存在する。]
[0127] １以上の糖は、好ましくは、スクロース、トレハロース及びそれらの混合物からなる群から選択される。スクロースが特に好ましい。]
[0128] ある実施形態において、１以上の糖の総濃度は、少なくとも約５０ｍＭ、例えば少なくとも約１００、２５０又は５００ｍＭなどである。１以上の糖の総濃度は、約５Ｍ以下、例えば約２．５Ｍ以下であり得る。ある実施形態において、１以上の糖の総濃度は１Ｍから２．５Ｍである、
１以上の不活性タンパク質は、血清アルブミン、ゼラチン及びそれらの混合物からなる群から選択される。「不活性タンパク質」という用語は、そのタンパク質がレポーターポリペプチド、関心のある検体又は基質と反応しないことを意味する。]
[0129] 血清アルブミンは、好ましくはウシ血清アルブミンである。ゼラチンの特定の例は魚ゼラチンである。]
[0130] ある実施形態において、１以上の不活性タンパク質の総濃度は、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約０．４又は０．５ｍｇ／ｍＬである。]
[0131] ここで、単なる実例であり非限定的な次の実施例を参照して本発明をさらに説明する。]
[0132] ネイティブウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）の位置２２９のグリシンと位置２３０のリジンとのの連結部の間への切断点の導入（図４）の結果、最適なα及びω断片が生成する。ＲＬｕｃの代替的な切断点の位置、例えば、位置９１のセリンと位置９２のチロシンとの間の切断点（これも本発明で示される。）由来のＦＥＣアッセイでもまた、操作可能な断片が生成する。可溶性、安定性、感度及び／又は酵素阻害剤に対する耐性に対処するための突然変異の組み合わせと併せて、機能的に必要とされるように、操作可能なＦＥＣアッセイ（図５）を設計し得る。インビトロでの改変断片の機能性は、主に、反応条件及び組成物に依存し、これなくして、グロー発光検出及び関連のあるＦＥＣシグナル対ノイズ比を得ることはできない。] 図４ 図５
[0133] 実施例１
グロー発光を用いた抗体検出に対する均一インビトロウミシイタケルシフェラーゼＦＥＣアッセイ
本明細書中で概説される手段は、アミノ酸２２９／２３０で全長親酵素を分割することにより生成するＲＬｕｃ断片の合成及び特性化を述べる。α断片（アミノ酸残基２−２２９）は、続いて、切断点末端で、フレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）３、ＨＳＶ−１（配列番号１、２及び３）又はＨＳＶ−２（配列番号４、５及び６）短縮抗原及びポリヒスチジンタグ（６Ｈ）に並列させた。酵素安定性を促進するために、α断片に単一点突然変異、Ｃ１２４Ａを導入し、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２検出に対してそれぞれ、ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１及びＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ２が生成された。ω断片（アミノ酸残基２３０-３１１）の切断点末端でのポリヒスチジンタグ（６Ｈ）、フレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）３及びタンパク質Ｇサブユニット（配列番号７及び８）の導入の結果、ＲＬｕｃ＿２３０ωＰｒｏＧと呼ばれる、ＩｇＧ抗体結合レポーター酵素断片が生成された。フレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）３、ポリヒスチジンタグ（６Ｈ）、点突然変異及び検体相互作用部分の位置を示すＤＮＡ配列データを与える。本発明で改変されたＲＬｕｃコンストラクトの概略図を図６で示す。全てのプラスミドの構築のために使用される対応する特注のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を表２で挙げる。これらの断片対メンバーを単離し、精製し、均一インビトロアッセイ方式で抗体検体（ヒスチジンタグに結合する抗ペンタ−ヒスチジンモノクローナル抗体）の存在下で強制酵素再構成を示すために使用した。] 図６
[0134] ウミシイタケルシフェラーゼ合成的合成
最適Ｅ．コリ発現のために、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）により、折り畳み及び安定性向上のためのＣ１２４Ａ突然変異（配列番号９及び１０）を組み込む全長ＲＬｕｃをコードするコドン最適化遺伝子を合成した。フィルターディスク上に合成ｐＪ３６−ＲＬｕｃプラスミド（２μｇ）を添加し、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いてこれを精製したが、これは、適切な緩衝液中でフィルターディスクを温置し、ＱＩＡｐｒｅｐスピンカラムに上清を置き、製造者の説明書に従い精製を完遂することによって行った。製造者の説明書に従い、精製プラスミドをＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピーテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ｃ／ｏ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に形質転換した。プラスミドが存在することを確認するためにコロニーをスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定によって（プライマーＲＬｕｃ１及びＲＬｕｃ２−表２を用いて）配列が完全であること調べた。]
[0135] タンパク質発現のための全長ウミシイタケルシフェラーゼのｐＥＴ２６サブクローニング
ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ｃ／ｏ Ｇｅｎｅｓｅａｒｃｈ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）での消化によってｐＪ３６−ＲＬｕｃからＲＬｕｃを切り出し、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＥＴ−２６ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（Ｅ．コリでの組み換えタンパク質の誘導発現を可能にする原核発現ベクター）に結合させた。製造者の説明書に従い、結合プラスミドでＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピーテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩでの制限消化によって、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）ベクター内にクローニングされた挿入配列が存在することを確認するために、各形質転換からの５個から１０個のコロニーをスクリーニングし、ゲル電気泳動により消化産物を分析した。ＤＮＡ配列決定によって（プライマー、ＲＬｕｃ１及びＲＬｕｃ２−表２を用いて）、陽性のクローンもまた確認した。]
[0136] ＲＬｕｃα及びω断片の生成
全ての増幅は、製造者の推奨に従い、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて行った。特異的プライマー（ＰＣＲに対して使用されるプライマーの説明のための表２−プライマー配列参照）を用いて、全長酵素からの適切な領域のＰＣＲ増幅によって、ＲＬｕｃ断片を作製した。ＲＬｕｃ切断点、Ｓ９１／Ｙ９２及びＧ２２９／Ｋ２３０の両方に対して、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２両方に対する抗体均一アッセイのための試薬を構成した。]
[0137] ｐＥＴ−ＲＬｕｃ α９１Ｐ１、ｐＥＴ−ＲＬｕｃ＿α９１Ｐ２、ｐＥＴ−ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１、ｐＥＴ−ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ２の構築
フォワードプライマーＲＬｕｃ３及びリバースプライマーＲＬｕｃ４を用いて、ＲＬｕｃ＿α９１（残基２−９１）を増幅させ、フォワードプライマーＲＬｕｃ３及びリバースプライマーＲＬｕｃ７を用いて、Ｃ１２４Ａ突然変異を組み込むＲＬｕｃ＿α２２９（残基２−２２９）を増幅させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて反応チューブから増幅産物を直接精製し、続いてＮｄｅＩ／ＫｐｎＩで消化し、Ｃ末端ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２特異的カセット［（Ｇ４Ｓ）３リンカー、短縮ＨＳＶ抗原（Ｐ１及びＰ２）、Ｇ４Ｓリンカー及びヒスチジンタグ（６Ｈ）］をコードする、ＮｄｅＩ／ＫｐｎＩで消化した各ユニバーサルｐＥＴ−αＰ１及びｐＥＴ−αＰ２プラスミドにクローニングし、それぞれ、ｐＥＴ−ＲＬｕｃ＿α９１Ｐ１（配列番号１９及び２０）、ｐＥＴ−ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１（配列番号２１及び２２）、ｐＥＴ−ＲＬｕｃ＿α９１Ｐ２（配列番号２３及び２４）及びｐＥＴ−ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ２（配列番号２５及び２６）を得た。連結したプラスミドでＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピーテント細胞を形質転換し、クローニングされた挿入物が存在することを確認するために、各形質転換からの選択コロニをスクリーニングした。ＤＮＡ配列決定により（プライマー、ＲＬｕｃ１及びＲＬｕｃ２−表２を用いて）陽性クローンを再び確認した。]
[0138] ｐＥＴ−ＲＬｕｃ＿ω９２ＰｒｏＧ及びｐＥＴ−ＲＬｕｃ＿ω２３０ＰｒｏＧの構築
フォワードプライマーＲＬｕｃ５及びリバースプライマーＲＬｕｃ６を用いて、Ｃ１２４Ａ突然変異を組み込むＲＬｕｃ＿９２ω（残基９２−３１１）を増幅させた。フォワードプライマーＲＬｕｃ８及びリバースプライマーＲＬｕｃ６を用いて、ＲＬｕｃ＿２３０ω（残基２３０−３１１）を増幅させた。ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩで増幅産物を消化し、Ｎ末端タンパク質Ｇサブユニット特異的カセット［ヒスチジンタグ（６Ｈ）、Ｇ４Ｓリンカー、タンパク質Ｇサブユニット（ＰｒｏＧ）及び（Ｇ４Ｓ）３リンカー］をコードするＮｄｅ／ＸｈｏＩ消化したユニバーサルｐＥＴ−ωＰｒｏＧプラスミドにそれぞれをクローニングし、ｐＥＴ−ＲＬｕｃ＿９２ωＰｒｏＧ（配列番号２７及び２８）及びｐＥＴ−ＲＬｕｃ＿２３０ωＰｒｏＧ（配列番号２９及び３０）を得た。連結したプラスミドでＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピーテント細胞を形質転換し、クローニングされた挿入物が存在することを配列確認によって確認するために、（プライマーＲＬｕｃ１及びＲＬｕｃ２−表２を用いて）各形質転換からの選択コロニーをスクリーニングした。]
[0139] ]
[0140] カセットドメインをコードするユニバーサルプラスミド
融合コンストラクトの操作を単純化するために、様々なドメイン配列の置換を可能にするための、酵素断片、リンカー及び結合部分の間に位置する制限エンドヌクレアーゼ部位を組み込むＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）によって、ユニバーサルαＰ１／２及びωＰｒｏＧ融合遺伝子を合成した。α配列、（Ｇ４Ｓ）３リンカー及び、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位への結合のために何れかの末端にＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ部位が付いた抗原コード部分の間にＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩ部位を有するように、ユニバーサルαＰ１／２コンストラクト、ｐＥＴ−αＰ１／２を設計した。同様に、ＰｒｏＧ、（Ｇ４Ｓ）３リンカー及び、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位への結合のために何れかの末端にＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ部位があるωコードドメインの間に挿入されたＢａｍＨＩ、ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩ部位を有するように、ユニバーサルωＰｒｏＧコンストラクト、ｐＥＴ−ωＰｒｏＧを設計した。ベクターＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｅ．コリのコドン使用表を使用し、公開されているアミノ酸配列（Ｇｕｌｉｃｈら、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１５（１０）：８３５−４２）の戻し翻訳（ｂａｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）によって、ストレプトコッカス株Ｇ１４８タンパク質ＧのＣ２ＩｇＧ−結合ドメインをコードする配列を得た。ドメイン間にある隣接する制限エンドヌクレアーゼ部位の位置は、本発明の添付される配列（配列番号１９、２１、２３、２５、２７及び２９）において文字に下線を付して示す。]
[0141] ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２抗原性ペプチド設計
血清中のＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対する抗体の間で検出及び区別を行うために、２種類のタイプ特異的短縮ＨＳＶ抗原を検体結合部分として設計した。ＨＳＶ−１特異的抗原（配列番号１、２及び３）は、糖タンパク質Ｇ１（ｇＧ１）の残基９２−１４８からなる。ｇＧ１のこの領域は、免疫優勢エピトープ（残基１１２−１２７）及び、ヒトにおいてＨＳＶタイプ１特異的反応をもたらすことが知られている第二のエピトープ内の２つのキーとなるアミノ酸を含有する。ＨＳＶ−２特異的ペプチド（配列番号４、５及び６）は、糖タンパク質Ｇ２（ｇＧ２）の残基５５１-６４１から構成され、ヒトにおいてＨＳＶタイプ２特異的反応をもたらすことが知られている２つの免疫優勢エピトープ（残基５６１−５７８及び６２６−６４０）からなる。]
[0142] α及びωＲＬｕｃ断片の発現
ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）における断片の発現を次のように行った：カナマイシン５０μｇ／ｍを添加したＬＢブロス１０ｍＬに関心のある１個のコロニーを接種し、液体培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩（〜１４時間）温置した。カナマイシン５０μｇ／ｍを添加したＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）２５０ｍＬへと一晩培養物を１：２５に希釈し、続いて３７℃、２５０ｒｐｍで２４時間、温置した。２，０５７ｇで３０分間（４℃）、細胞をペレット化し、−２０℃で６ヶ月未満保存した。]
[0143] α及びωレポーター断片の精製
全ての酵素断片（ＲＬｕｃ＿α９１Ｐ１、ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１、ＲＬｕｃ＿α９１Ｐ２、ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ２、ＲＬｕｃ＿９２ωＰｒｏＧ及びＲＬｕｃ＿２３０ωＰｒｏＧ）を変性条件下で抽出し、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムにおいて再折り畳みを行った（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。抗ペンタ−ヒスチジンモノクローナル抗体との強制酵素再構成においてそれらの触媒速度及びシグナル対ノイズ比を直接比較するために、全ての精製タンパク質の特性を調べ、同様にしてアッセイした。]
[0144] 変性条件下での組み換えタンパク質の抽出
２５０ｍＬの一晩誘導物からのペレットを溶解緩衝液（６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、２０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ８）１０ｍＬ／ｇ（湿潤ペレット重量）で溶解させた。１００ｒｐｍで振盪しながら４℃で１時間温置した後、Ｂｒａｎｓｏｎ２５０超音波処理装置を用いて、氷浴中で３０秒オン／３０秒オフ５サイクル（７０％負荷サイクル）で、各縣濁液を超音波処理した。１８，５１４ｇで４℃にて３０分間遠心することによって、可溶性タンパク質を回収した。上清（１０ｍＬ）を０．２μｍフィルターに通した。]
[0145] ＲＬｕｃ＿αＰ１、ＲＬｕｃ＿αＰ２及びＲＬｕｃ＿ωＰｒｏＧの固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びカラム上での再折り畳み
ＦＰＬＣに対して使用されるクロマトグラフィー装置及びカラムは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の製品であった。４℃にて、Ｕｎｉｃｏｒｎ５．１コントローラーソフトウェアを用いてＡＫＴＡ−精製装置の制御下で１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐＴＭＨＰカラムを用いて融合タンパク質を精製した。１ｍＬ／分の流速で勾配緩衝液（８Ｍ尿素、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８）１０カラム体積（ＣＶ）でＨｉｓＴｒａｐカラムを平衡化した。注入バルブ（ＩＮＶ−９０７）を介して試料を直接注入するために、１ｍＬ／分で５０ｍＬスーパーループを用いて、透明化Ｅ．コリ溶解物をカラムに直接載せた。１ｍＬ／分で、８Ｍ尿素、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８から１００ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８まで２０ＣＶ勾配を通じて、結合タンパク質を再び折り畳ませた。５０ｍＭイミダゾール、１００ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５ １０ＣＶ、続いて１００ｍＭイミダゾール、１００ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の第二の１０ＣＶ洗浄で、カラムから洗浄夾雑タンパク質を洗浄除去した。５００ｍＭイミダゾール、１００ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５ １０ＣＶでヒスチジンタグ付加タンパク質を溶出し、１ｍＬ分画になるように回収した（図７及び８）。ＮｕＰＡＧＥ（Ｒ）Ｎｏｖｅｘ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、各クロマトグラフィー操作からの分画を純度について評価した。タンパク質ピークを含有する分画（２．５ｍＬ）を集め、ＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて５０％グリセロール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に緩衝液交換し、−２０℃で保存した。−２０℃での保存前にＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、ｃ／ｏ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｒｉｃ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いてタンパク質を定量した。] 図７
[0146] ゲルろ過
ある場合には、酵素断片のアフィニティー精製後、Ｕｎｉｃｏｒｎ ５．１コントローラーソフトウェアを用いて、ＡＫＴＡ−精製装置の制御下で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＧＬカラムを用いて、プール溶出物をサイズ排除クロマトグラフィーに共した。精製酵素断片のポリッシング（夾雑タンパク質の除去）又はカラム上での再折り畳みの何れかの後の凝集酵素断片に対する単量体の割合を調べるために、ゲルろ過を使用した。このプロトコールは次のとおりであった：０．６ｍＬ／分での５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７ ２ＣＶによる平衡化；０．６ｍＬ／分での試料２５０−５００μＬの注入；及び０．６ｍＬ／分での５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７ １ＣＶの定組成フロー。典型的な結果として図８参照。] 図８
[0147] 質量分析
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、ＡｕｓｔｒａｌｉａのＨＰＬＣ／ＴＯＦ質量分析サービスを用いて、精製タンパク質の分子量を確認した。個々の実験データを回収し、理論的分子量値と比較するために分析した。]
[0148] 全長ウミシイタケルシフェラーゼを用いたグロー発光の開発
診断目的のための発光シグナル検出の使用には、高い試料処理性及び高スループットに適合する読み取り易い方式が必要である。全長ＲＬｕｃからの発光は通常、秒又はミリ秒内に最大光強度に到達するフラッシュ発光として記録される。光放射の速度ゆえに、この反応は、光検出装置の直前で開始され記録される（基質添加と検出との間の時間間隔が試料間で一定に維持される。）必要がある。代替的検出法はグロー発光、定常速度論的シグナル（ｓｔｅａｄｙ ｓｔａｔｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌ）である。検出チャンバーの外側で反応を開始することができ、より感度が高く再現性の高い結果が得られるので、一定シグナルは好ましい。発明者らは、グロー発光を生じさせるための反応条件を順応させるために市販のウミシイタケルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）と組み合わせて全長ＲＬｕｃを用いてアッセイを行った。以前の開示、米国特許第５，６１８，６８２号及び同第６，１７１，８０９号は、それぞれホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼに対する、フラッシュ発光シグナルのグローシグナルへの変換のためのジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の使用を示した。]
[0149] 本明細書中に記載のようにアッセイを行った。９６ウェル白色Ｃｏｓｔａｒプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中の１００μＬの最終反応体積中で、リン酸ナトリウムｐＨ７とＲＬｕｃ（２０ｎＭ）を組み合わせた。５ｍＭ ＤＴＴ、１ｘＰｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液（ＰＬＢ、特許組成物）、５ｍＭＥＤＴＡ及び対照血清（１／１００）の組み合わせを添加し、Ｐｒｏｍｅｇａアッセイ緩衝液（特許組成物）の使用と比較した。反応設定後すぐに、１００ｘアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、特許組成物）１μＬを添加し、ＬｍａｘＩＩ３８４照度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いてウェルあたり１秒積分で１０分間にわたり光放射を測定した。グロー発光の程度を調べるために、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ Ｖ５ソフトウェアを用いて速度（ｍＲＬＵ・分−１）を計算した。]
[0150] アッセイ結果（表３）は、効果を促進する、ＥＤＴＡ及び血清でのグロー発光の生成に対するＤＴＴ及び溶解緩衝液の両方の要件を示す。]
[0151] 酵素断片再構成
抗ペンタ−ヒスチジンモノクローナル抗体（Ｈｉｓ ＭＡｂ；Ｍｅｒｃｋ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に結合し得るポリヒスチジンタグ（６Ｈ）を含有する精製α及びω断片は、２つの代替的分割点（Ｓ９１／Ｙ９２及びＧ２２９／Ｋ２３０）により生じる断片の機能性を比較するために使用した。さらに、最適な試薬組成物を評価し決定するために、シグナル（Ｈｉｓ ＭＡｂ強制酵素再構成）及びノイズ（Ｈｉｓ ＭＡｂなしの自発的な酵素再構成）における様々な基質及び緩衝添加物の影響を調べた。]
[0152] 分割点Ｓ９１／Ｙ９２とＧ２２９／Ｋ２３０との間のＨｉｓ ＭＡｂ介在性ＦＥＣの比較
下記で示されるようなウミシイタケルシフェラーゼアッセイキット（Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）からの成分を用いて、９６ウェル白色Ｃｏｓｔａｒプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中でＲＬｕｃ ＦＥＣアッセイを行った。０．５ｘＰＬＢ、０．５ｘＰＢＳｐＨ７．３、０．５Ｍ ＮａＣｌ及びＨｉｓ ＭＡｂ検体（図９で示されるように、５ｎＭ→２５ｎＭ）を含有する２００μＬの最終反応体積に、可変α（ＲＬｕｃ＿α９１Ｐ１又はＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１）及びω（ＲＬｕｃ＿ω９２ＰｒｏＧ又はＲＬｕｃ＿ω２３０ＰｒｏＧ）断片濃度（図９で示されるように５ｎＭ→５０ｎＭ）を添加した。プラットフォームロッカー上で、この反応を室温（ＲＴ）にて３０分間温置した。次に、２．５ｍＭの最終濃度に対してＤＴＴを添加し、次いで１００ｘＰｒｏｍｅｇａアッセイ基質１μＬを添加した。ＬｍａｘＩＩ３８４照度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いてウェルあたり１秒積分で１０分間にわたり光放射を測定した。シグナル対ノイズ比を計算するために、最初の２０Ｖｍａｘ点にわたり速度（ｍＲＬＵ・分−１）を計算した（ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ Ｖ５ソフトウェアを使用）。] 図９
[0153] 図９で与えられるシグナル対ノイズ比は、Ｇ２２９／Ｋ２３０で分割された５ｎＭ断片とＳ９１／Ｙ９２で分割された５０ｎＭ断片との間で同等であったことが分かった。Ｇ２２９／Ｋ２３０で分割された５ｎＭ断片により放射された光もまた、Ｓ９１／Ｙ９２で分割された５０ｎＭ断片により放射される光と同様であり、ゆえに、特に２０ｎＭ断片のＳ９１／Ｙ９２光放射が１ＲＬＵ以下であり、５ｎＭ断片の光放射は検出不能であったので、Ｇ２２９／Ｋ２３０分割点は、Ｈｉｓ ＭＡｂ介在ＦＥＣを行う能力が優れている。] 図９
[0154] アッセイ感度の改善のための、Ｇ２２９／Ｋ２３０で分割されたＲＬｕｃ断片の、Ｈｉｓ ＭＡｂ介在インビトロＦＥＣの最適化
従来から１ｘＭａｔｔｈｅｗ’ｓ緩衝液（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９７７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６（１）：８５−９１）として知られるウミシイタケルシフェラーゼインビトロアッセイ緩衝液は、
１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６
５００ｍＭ塩化ナトリウム
１ｍＭエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム塩（Ｎａ２ＥＤＴＡ）
０．０２％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
０．６ｍＭアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）
からなる標準的組成を有する。]
[0155] さらにＭａｔｔｈｅｗ’ｓ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｍａｎｕａｌ Ｐａｒｔ＃ＴＭ０５５）は、
１５０ｍＭ ４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスロン（ｅｔｈａｎｅｓｕｌｏｎｉｃ）酸（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ８、
０．２５％オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）
１ｍｇ／ｍＬブタゼラチン
１０％グリセロール
０．０５％消泡剤２８９
からなる組成を有する。]
[0156] ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１及びＲＬｕｃ＿ω２３０ＰｒｏＧ Ｈｉｓ ＭＡｂ強制断片再構成のシグナル対ノイズ比を改善するために、基準（ここから成分を変更する。）として標準的ウミシイタケルシフェラーゼインビトロアッセイ緩衝液（１ｘＭａｔｔｈｅｗ’ｓ緩衝液）及びＭａｔｔｈｅｗ’ｓ溶解緩衝液を使用した。よって、様々な緩衝液及び、塩、金属キレート剤、溶媒、界面活性剤及びタンパク質変性剤などの緩衝添加物の影響を調べた。本明細書中に記載のようにアッセイを行った。]
[0157] 示されるように、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）からの成分を用いて、上述のような９６−ウェル白色Ｃｏｓｔａｒプレートにおいて、ＲＬｕｃ ＦＥＣアッセイを行った。アッセイ緩衝液（表４参照）、１ｘＰＬＢ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ及び対照血清（１／１００）を含有する１００μＬの最終反応体積に、５ｎＭ α（ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１）及びω（ＲＬｕｃ＿ω２３０ＰｒｏＧ）断片を添加した。すぐに、反応設定後、Ｈｉｓ ＭＡｂ（５ｎＭ）を添加し、撹拌せずに反応物をＲＴで１０分間温置した。Ｐｒｏｍｅｇａ１００ｘアッセイ基質（反応あたり１μＬ）を添加し、速度論的読み取りのためにウェルあたり１秒積分で１０分間にわたり光放射を測定した。続いて、ＬｍａｘＩＩ３８４照度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、５秒積分でエンドポイント読み取りを行った（速度論的読み取りの終了時）。シグナル対ノイズ比を調べるために、最初の５０−１００のＶｍａｘ点にわたり（ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ Ｖ５ソフトウェアを用いて）、速度（ｍＲＬＵ・分−１）を計算した。各反応成分を個々に試験し、必要に応じて成分を置き換えた。具体的反応条件を下記で述べる。]
[0158] 緩衝液比較
最初に、上述のように最適なシグナル対ノイズ比を得るために、ベース緩衝液及びｐＨを評価した。リン酸カリウム（ＫＰｉ）ｐＨ７．４、リン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）ｐＨ７．４、トリス塩酸塩（Ｔｒｉｓ ＨＣｌ）ｐＨ７．４及びＰｒｏｍｅｇａアッセイ緩衝液（ｐＨ不明）を含む４種類の緩衝液を試験した。次に最良の緩衝液（表４）を選択し、６−８．５のｐＨ範囲を評価した（表５）。]
[0159] ]
[0160] ]
[0161] 実験結果から、１／１００希釈血清の存在下で、ある種の緩衝液の使用が（Ｈｉｓ ＭＡｂ強制酵素再構成により生成される）発光シグナルの速度に影響を与えること、ならびに、自然発生的／自己再構成（検体非存在下でのバックグラウンド発光）の速度に影響を与え、その結果、シグナル対ノイズ比が変化しやすくなることが示される。Ｔｒｉｓ ＨＣｌはバックグラウンド発光を制限し、同時に優れた発光出力を維持し、その結果、特にｐＨ７．０で、シグナル対ノイズ比が最良となる。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０を用いて、全ての次の反応を行った。]
[0162] 金属キレート剤
金属キレート化による可逆的なプロセスである２価金属陽イオンによりネイティブＲＬｕｃが阻害される（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９７７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６（１）：８５−９１）。さらに、例えば、亜鉛（７０−１５０μｇ／ｄＬ）、銅（７０−１５５μｇ／ｄＬ）、鉄（６０−１８０μｇ／ｄＬ）及びマンガン（０．０４−１．４μｇ／ｄＬ）を含む、高レベルの金属陽イオンを含有するヒト血清試料中の検体の検出のためにＦＥＣが設計される（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎ．Ｗ．Ｔｅｉｔｚ編、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８７）。従って、金属キレート剤の使用は、ヒト血清検体検出に対して必須である。次のようにアッセイを準備した：１００μＬの最終反応体積中で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．０、１ｘＰＬＢ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ及び対照血清（１／１００）存在下で、各断片（ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１及びＲＬｕｃ＿ω２３０ＰｒｏＧ）の５ｎＭをＥＤＴＡ（１０ｍＭから１ｍＭ）の希釈系列に添加した。第一のウェルセットに、５ｎＭ Ｈｉｓ ＭＡｂを添加し、混合し、一方で、第二のセットにはＨｉｓ ＭＡｂが含有されなかった。ＲＴで１０分間プレートを温置し、その後、１μＬ Ｐｒｏｍｅｇａ １００ｘアッセイ基質をウェルごとに添加し、ウェルあたり１秒積分で１０分間にわたり光放射の動態を測定した。次に、ＬｍａｘＩＩ３８４照度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、５秒積分で（速度論的読み取りの終了時に）エンドポイント読み取りを行った。最初の５０−１００のＶｍａｘ点にわたり（ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ Ｖ５ソフトウェアを用いて）計算した反応の速度（ｍＲＬＵ・分−１）を比較することによって、シグナル対ノイズ比を調べた。例えば１０ｍＭ、５ｍＭ及び１ｍＭの最終濃度でのＥＤＴＡの影響を調べ、シグナル対ノイズ比は、それぞれ速度論的読み取り又はエンドポイント測定に対して、それぞれ１９．５４、２４．６１及び２５．９５及び８．６６、１０．０４及び９．７０であった。]
[0163] １／１００希釈された血清の存在下で、最適なシグナル対ノイズ比を得るために、金属キレート剤の濃度のある種の範囲が必要であることが観察され、これは、この場合、５ｍＭＥＤＴＡにより達成された。従って、予防措置として、金属陽イオンによる再構成ＲＬｕｃ活性の阻害を制限するために、全ての次の反応に５ｍＭ ＥＤＴＡを入れた。]
[0164] 塩
静電効果は、基質触媒及びタンパク質−タンパク質相互作用の両方において重要な機能を有し、これらの影響は、様々な塩濃度を用いて調節又は修飾することができる。強制酵素再構成における、及び得られる光放射（表５）における、、様々な塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度の影響を調べるために、様々な塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度を試験した。次のようにアッセイを準備した：１００μＬの最終反応体積中で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．０、１ｘＰＬＢ、５ｍＭ ＤＴＴ及び対照血清（１／１００）の存在下で、各断片（ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１及びＲＬｕｃ＿ω２３０ＰｒｏＧ）５ｎＭをＮａＣｌ（１Ｍ、０．７５Ｍ、０．５Ｍ、０．２５Ｍ及び０Ｍ）の希釈系列に添加した。ウェルの第一のセットに、５ｎＭ Ｈｉｓ ＭＡｂを添加し、混合し、一方で、第二のセットにはＨｉｓ ＭＡｂは含有されなかった。プレートをＲＴで１０分間温置し、その後、１μＬ Ｐｒｏｍｅｇａ １００ｘアッセイ基質をウェルごとに添加し、ＬｍａｘＩＩ３８４照度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、ウェルあたり１秒積分で１０分間にわたり光放射の動態を測定した。]
[0165] ]
[0166] 反応からのＮａＣｌがないと、バックグラウンド自己発光／自己再構成が非常に高くなり、一方で、光放射速度も非常に高くなることが分かった（表６）。これにより、シグナル対ノイズ比が悪くなり、したがって、０．２５Ｍ ＮａＣｌを入れることにより、反応速度を高く、バックグラウンド発光の速度を低く維持することができ、その結果、シグナル対ノイズ比が高くなる。ＦＥＣアッセイへの０．５Ｍ以上のＮａＣｌの添加は、さらなる利点は何らもたらさないが、シグナルに悪影響がある。]
[0167] 還元剤
還元剤の使用は、フラッシュ放射ではなく、長時間発光型グロー発光を生成させるために必須であることが示された（表３参照）。標的抗体などのタンパク質に存在する重要なジスルフィド結合を減少させず、従って検体の完全性を確実に維持する一方で、長時間発光型グロー発光シグナルが妨害されないことを確実にするために、還元剤濃度を実験的に決定することは重要である。光放射及び検体の強制酵素再構成誘導能におけるＤＴＴ濃度の影響を調べるために、様々なＤＴＴ濃度を調べた（表７）。試験されるＤＴＴの最終濃度は５ｍＭ、２ｍＭ及び１ｍＭであり、次のようにアッセイを準備した：１００μＬの最終反応濃度中で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．０、１ｘＰＬＢ、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ及び対照血清（１／１００）に、各断片（ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１及びＲＬｕｃ＿ω２３０ＰｒｏＧ）５ｎＭを添加した。ウェルの第一のセットに５ｎＭ Ｈｉｓ ＭＡｂを添加し、一方で、対照ウェルにはＨｉｓ ＭＡｂは含有されなかった。ＲＴで１０分間プレートを温置し、その後、１μＬ Ｐｒｏｍｅｇａ １００ｘアッセイ基質を各ウェルに添加し、光放射の動態をウェルあたり１秒積分で１０分間にわたり測定した。続いてＬｍａｘＩＩ３８４照度計を用いて、（速度論的読み取りの終了時に）５秒積分でエンドポイント読み取りを行った。]
[0168] ]
[0169] ＤＴＴの濃度が上昇すると、その結果、速度論的又はエンドポイント読み取りの何れかで測定した場合、断片自己会合（バックグラウンド）のレベルが上昇し、光放射が増加し得ることが観察された（表７）。従って、必要とされる最適ＤＴＴ濃度は、最良のシグナル対ノイズ比の生成の間のバランスである。さらに、ＤＴＴの一時的添加は、高いシグナル対ノイズ比の維持に重要である。検体温置時間終了時のＤＴＴ添加のシグナル対ノイズ比は、検体温置前に反応にＤＴＴを添加した場合よりも低く、それぞれ、速度論的読み取りで７．１：１及び７４：１又はエンドポイント読み取りで４．３：１及び５．８：１である。]
[0170] 変性剤
ＦＥＣ技術を用いた以前の実験から、ある程度のタンパク質変性は、互いに対するレポーター酵素断片の天然の親和性（自然発生的再構成）を最小限に抑えるために必須であり、同時に、検体により断片が近接近にされる場合、相互作用及び構造変化（強制再構成）を可能にすることが示された。さらに、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）はセレンテラジン自己酸化の主な原因であることが既に報告されている（Ｚｈａｏら、２００４、Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ３、４３−５４）。ヒト血清がＦＥＣ開発に対して主な試料媒体であり、健常ヒト血清においてＨＳＡ参照範囲が３．５−５．０ｇ／ｄＬ（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎ．Ｗ．Ｔｅｉｔｚ編、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８７）であることを考え、発明者らは、チオ尿素誘導体がアルブミンに結合し、強い変性剤として作用することの両方ができることを見出した（Ｃｕｉら、２００７、Ａｎａｌ Ｓｃｉ ２３、７１９−７２５）。さらに、米国特許第７，１１８，８７８号は、検体依存性発光に影響を与えることなく検体非依存性発光を効果的に減少させるためのチオ尿素の使用を記載する。アッセイを行い、各断片（ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１及びＲＬｕｃ＿ω２３０ＰｒｏＧ）５ｎＭを用いて、６％ｗ／ｖ−０％ｗ／ｖの範囲のチオ尿素の濃度を試験した。１００μＬの最終反応体積の、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．０、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、対照血清（１／１００）及び、１ｘエンハンサー緩衝液（３０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８．０、１０％グリセロール、０．２％ＣＨＡＰＳ）の自家製剤中で、反応を行った。ウェルの第一のセットに５ｎＭ Ｈｉｓ ＭＡｂを添加し、一方で、ウェルの第二のセットにはＨｉｓ ＭＡｂを添加せず、ＲＴで１０分間反応を温置し、その後、１μＬ Ｐｒｏｍｅｇａ １００ｘアッセイ基質を各ウェルに添加し、光放射の動態（１秒積分で１０分間）及びエンドポイント読み取り（５秒積分）をＬｍａｘＩＩ３８４照度計で記録した。]
[0171] ]
[0172] この結果（表８）から、およそ１．４％ｗ／ｖのチオ尿素の添加は、ＦＥＣ由来光放射を増加させ、同時にバックグラウンドを減少させることにより、最適なシグナル対ノイズ比を得るために必須であることが分かる。特に、反応条件からのチオ尿素の欠落の結果、自己発光／断片自己会合が非常に多くなる。低濃度のチオ尿素（２％以下）で、酵素断片が部分的に変性され、それにより互いに対するそれらの天然の親和性が低下し、自然発生的な再構成を制限し、一方で、検体により近接近にされる場合、相互作用及び構造変化（強制再構成）が依然として可能となることが理解された。チオ尿素はまた、おそらく、ＨＳＡにより引き起こされるセレンテラジン自己酸化も制限する。]
[0173] 界面活性剤
界面活性剤は、免疫アッセイにおいてタンパク質−タンパク質相互作用及び非特異的結合を減少させるために広く使用される。検体非存在下での断片の自己会合を減少させるためのＦＥＣでのイオン性界面活性剤の使用は、さらにシグナル対ノイズ比を上昇させるために重要である。発明者らは、チオ尿素の使用により、穏やかに変性させる環境中で既に維持されているＲＬｕｃ断片の何らかのさらなる変性を制限するために、非変性両性イオン界面活性剤３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）を選択した。１００μＬの最終反応体積の、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．０、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、対照血清（１／１００）及び、１ｘエンハンサー緩衝液（３０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８．０、１０％グリセロール、１．４％ｗ／ｖチオ尿素）の自家製剤中の、各断片（ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１及びＲＬｕｃ＿ω２３０ＰｒｏＧ）５ｎＭの存在下で、ＣＨＡＰＳの様々な濃度（２％ｗ／ｖ−０％ｗ／ｖ）を試験した。検体（５ｎＭ Ｈｉｓ ＭＡｂ）を添加し、反応物をＲＴで１０分間温置した。次に、各ウェルに基質を添加し（１μＬ Ｐｒｏｍｅｇａ １００ｘアッセイ基質）、ＬｍａｘＩＩ３８４照度計を用いて光放射の動態（１秒積分で１０分）及びエンドポイント測定値（５秒積分）を読んだ。]
[0174] ]
[0175] 界面活性剤のある一定の濃度、例えば０．１％ｗ／ｖ−０．２％ｗ／ｖＣＨＡＰＳ（表９）で、検体由来ＦＥＣシグナルの低下よりも大幅にバックグラウンド発光シグナルを低下させることにより、効果的にシグナル対ノイズ比が上昇した。]
[0176] エンハンサー緩衝液組成物の比較
Ｍａｔｔｈｅｗ’ｓ溶解緩衝液は、ＲＬｕｃレポーター酵素を発現する哺乳動物細胞の再縣濁のために使用される。発明者らは、既に、市販のウミシイタケルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた全長ＲＬｕｃからの長時間発光型グロー発光の生成が、ＤＴＴ及びＥＤＴＡ、ならびにウミシイタケルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）の５ｘＰｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液（ＰＬＢ）成分（特許組成物）の添加に依存すると判断した。従って、発明者らは、既知のＭａｔｔｈｅｗ’ｓ溶解緩衝液組成物を用い、本発明で挙げられる観察に基づき、自家５ｘエンハンサー緩衝液を処方した。自家５ｘエンハンサー緩衝液を次のように処方した：
５ｘＰＢエンハンサー緩衝液Ａ
１５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８
１％ＣＨＡＰＳ
５％チオ尿素
５０％グリセロール
５ｘＰＢエンハンサー緩衝液Ｂ
１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８
１％ＣＨＡＰＳ
７％チオ尿素
５０％グリセロール
５ｘＰＢエンハンサー緩衝液Ｃ
１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８
１％ＣＨＡＰＳ
５％チオ尿素
２５％グリセロール。]
[0177] 発明者らは、１００μＬの最終反応体積での５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．０、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ＤＴＴ及び対照血清（１／１００）中の各断片（ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１及びＲＬｕｃ＿ω２３０ＰｒｏＧ）の５ｎＭの存在下で、各エンハンサー緩衝液（１ｘ最終濃度）を試験した。ウェルの第一のセットに対して、５ｎＭ Ｈｉｓ ＭＡｂを添加して混合し、一方、第二のセットにはＨｉｓ ＭＡｂは含有されなかった。このプレートをＲＴで（１０分間）温置し、１μＬ Ｐｒｏｍｅｇａ １００ｘアッセイ基質を添加した。ＬｍａｘＨ３８４照度計を用いて、速度論的（１０分間、１秒積分）及びエンドポイント（５秒積分）測定値を得て、シグナル対ノイズ比を上記のように決定した。]
[0178] ]
[0179] それぞれ速度論的及びエンドポイント読み取りにより、Ｐｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液を用いて得られるシグナル対ノイズ比よりも、ＰＢエンハンサー緩衝液Ｃによってシグナル対ノイズ比が２．３倍及び１．３倍上昇し得ることが観察された（表１０）。血清１／１００希釈物存在下での５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．０、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ及び２．５ｍＭ ＤＴＴと組み合わせて、ＰＢエンハンサー緩衝液Ｃ（３０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、０．２％ＣＨＡＰＳ、１％チオ尿素、５％グリセロール−最終反応濃度）により、優れたシグナル（３７ｍＲＬＵ・分−１）を得ることができ、自己会合／自己発光（０．４ｍＲＬＵ−分−１）は無視できる程度となり、結果として、それぞれ速度論的及びエンドポイント読み取りにより、シグナル対ノイズ比が、９６：１及び１４：１となる（典型的結果は図１０で示される。）。] 図１０
[0180] セレンテラジン類似体の比較
ネイティブセレンテラジンの合成類似体（図３）により、発光強度及び反応時間が変化する（Ｉｎｏｕｙｅら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３３、３４９−３５３）。ＲＬｕｃ ＦＥＣにより、Ｐｒｏｍｅｇａ １００ｘアッセイ基質を用いて優れた結果が得られるが、組成及び基質濃度は分からない。発明者らは、ネイティブセレンテラジンに対して及びＰｒｏｍｅｇａ １００ｘアッセイ基質に対して、８種類の合成セレンテラジン類似体を比較した。１００μＬの最終反応体積で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．０、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、１ｘＰＢエンハンサー緩衝液Ｃ及び対照血清（１／１００）中で、ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１及びＲＬｕｃ＿ω２３０ＰｒｏＧ（５ｎＭ）をアッセイした。検体を添加し（５ｎＭ Ｈｉｓ ＭＡｂ）、プレートをＲＴで温置した（１０分間）。保存セレンテラジン基質（セレンテラジンサンプラーキット、Ｓｉｇｍａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を１００％エタノール中で再懸濁し（５００μＭ基質）、５μＭの最終濃度で使用した。従って、検体温置終了時にＰｒｏｍｅｇａ １００ｘアッセイ基質を含むセレンテラジン基質１μＬをアッセイに添加し、ＬｍａｘＩＩ３８４照度計を用いて読み取った。速度論的（１秒積分で１０分間）及びエンドポイント（５秒積分）測定値を得て、シグナル対ノイズ比を計算した。] 図３
[0181] ]
[0182] 合成セレンテラジンｈ類似体は、その他の基質類似体よりも優れているが（表１１）、５μＭで合成セレンテラジンｈ類似体は、Ｐｒｏｍｅｇａアッセイ基質により得られたものの１／２（エンドポイント）であるシグナル対ノイズ比をもたらすことが観察された。現在のＰＢアッセイ及びＰＢエンハンサー緩衝液組成物に対して一部改変を行った、ネイティブセレンテラジン及びセレンテラジン類似体ｆ、ｈ及びｎのさらなる試験の結果、ヒト血清の存在下で、検体により近接近になるよう強制されるＲＬｕｃ断片により生じる光放射がさらに改善される。速度論的又はエンドポイント測定の何れかを用いた５μＭセレンテラジン基質類似体を利用するアッセイにおいて、バックグラウンド発光（自己発光／断片自己会合）が皆無であることは、とりわけ興味深い。]
[0183] 実施例２
均一インビトロウミシイタケルシフェラーゼＦＥＣ試薬保存緩衝液成分
全長ＲＬｕｃは、失活しやすく、４℃での０．５ｍｇ／ｍＬより高い濃度での保存の際に凝集する傾向がある（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９７７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６（１）：８５−９１）。アミノ酸２２９／２３０で全長ＲＬｕｃ親酵素を分割し、続いて検体相互作用部分を付加することにより、組み換え断片の活性及び安定性を失いやすい傾向が促進され得ることが予想される。実際に、単量体酵素から断片が生じる結果、疎水性コアが露出し得、その結果、保存時の凝集が起こる。酵素安定性を促進するためにＲＬｕｃのα断片に導入された単一点突然変異、Ｃ１２４Ａ（Ｌｉｕら、１９９９、Ｇｅｎｅ ２３７：１５３−１５９）により、これらの問題はある程度対処される。しかし、断片保存緩衝液に添加される化学成分は、ＦＥＣプロセスに影響を与えることなく保存中のタンパク質安定性に対応するための有益な方法である。本明細書中で概説される手順は、４℃で保存されるＲＬｕｃ断片の希釈濃度の半減期を延長させるために使用される成分を述べる。この実施例で使用されるＲＬｕｃ断片には、ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１及びＲＬｕｃ＿２３０ωＰｒｏＧが含まれ、それらの合成及び特性評価を本発明の実施例１で述べる。]
[0184] ＲＬｕｃ断片安定化賦形剤
溶液中のタンパク質の希釈濃度の安定性を向上させることが知られている緩衝添加剤は、溶媒、不活性タンパク質及び糖から構成され得る。還元剤、疎水性添加剤、プロテアーゼ阻害剤及び抗菌剤を添加することにより、保存時に、タンパク質分解を減少させることができる。最後に、長期間のタンパク質保存のために、凍結乾燥を使用することもできる。この実施例において、発明者らは、α及びω精製断片両方の希釈標準溶液（１００ｎＭ）の安定性を向上させることに焦点を当てる。４℃での断片長期保存後の、Ｈｉｓ ＭＡｂ介在性ＦＥＣにより調べた場合の断片の完全性及び活性を維持する能力について、糖（トレハロース及びスクロース）及び不活性タンパク質（ＢＳＡ及びゼラチン）を試験した。１．５Ｍトレハロース、１．５Ｍスクロース、２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）、２ｍｇ／ｍＬ魚ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）及び５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０の溶液中へ個々の精製断片を溶解することによって、個別のα及びω断片希釈標準溶液（１００ｎＭ）を調製した。本明細書中に記載のようにアッセイを行った；１００μＬの最終反応体積中で、様々な安定化溶液からの各断片（ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１及びＲＬｕｃ＿ω２３０ＰｒｏＧ）の５ｎＭを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．０、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、対照血清（１／１００）及び１ｘＰＬＢに添加した。検体（５ｎＭ Ｈｉｓ ＭＡｂ）を添加し、この反応物をＲＴで１０分間温置した。次に基質を各ウェルに添加し（１μＬ Ｐｒｏｍｅｇａ １００ｘアッセイ基質）、ＬｍａｘＩＩ３８４照度計を用いて光放射の動態（１秒積分で１０分間）及びエンドポイント測定値（５秒積分）を読んだ。最長６日間の保存で、４℃で、様々な時間間隔でアッセイを繰り返した。]
[0185] ]
[0186] スクロース、ＢＳＡ及び魚ゼラチン中での断片溶解により、４℃で最長６日間保存された低濃度断片が良好に安定化され、その結果、シグナル対ノイズ比が高くなった（表１２）。５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０中で保存された断片の酵素活性は著しく低下し、その結果、それぞれ速度論的及びエンドポイント読み取りに対して光放射が８０％及び７６％低下した。次のもの：０．７５Ｍスクロース、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（希釈液＃１）及び０．７５Ｍスクロース、１ｍｇ／ｍＬ魚ゼラチン（希釈液＃２）と組み合わせて混合した、半分に希釈した溶液から構成された安定化溶液も、４℃で最長１８日間保存した後、上記のように試験した（表１３）。]
[0187] ]
[0188] 糖及び不活性タンパク質のある一定の濃度の組み合わせにより、良好な光放射が維持され得、バックグラウンド（自己発光／断片自己会合）は無視できる程度となり、診断学的に適切なシグナル対ノイズ比が維持され得ることが観察された。４℃での長期ＲＬｕｃ断片保存（１８日間）の結果、安定性が向上し、最終産物の凝集が低下し、この両方によって、ＲＬｕｃに基づく均一インビトロＦＥＣアッセイの商業化に対する顕著な長所が得られる。]
[0189] 実施例３
グロー発光を用いたポリクローナルＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２ＩｇＧ特異的患者抗体検出に対する均一インビトロウミシイタケルシフェラーゼＦＥＣアッセイ
実施例１及び２は、アミノ酸２２９／２３０で全長親酵素（ＲＬｕｃ）を分割することにより生じたＲＬｕｃ断片の合成、精製及び特性評価を述べる。単一点突然変異（Ｃ１２４Ａ）を組み込むα断片を切断点末端でフレキシブルリンカー［（Ｇ４Ｓ）３］、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２短縮型抗原及びポリヒスチジンタグに連結し、その結果、それぞれＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２検出に対して、ＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ１及びＲＬｕｃ＿α２２９Ｐ２が生成される。ω断片の切断点末端でのポリヒスチジンタグ、フレキシブルリンカー及びタンパク質Ｇサブユニットの導入の結果、ＲＬｕｃ＿２３０ωＰｒｏＧと呼ばれるＩｇＧ抗体結合レポーター酵素断片が生成された。ＰＢアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．０、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ５ ２．５ｍＭ ＤＴＴ）及び、本発明の５ｘＰＢエンハンサー緩衝液Ｃ（１５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１％ＣＨＡＰＳ、５％チオ尿素及び２５％グリセロール）を使用した最適化均一インビトロアッセイ方式において、抗体検体（ヒスチジンタグに結合する抗ペンタ−ヒスチジンモノクローナル抗体）の存在下で強制酵素再構成を明らかにするために、これらの断片対メンバーを使用した。]
[0190] この実施例において、均一インビトロアッセイ方式における強制酵素再構成によって患者血清試料中の疾患特異的ＩｇＧ抗体（それぞれ、Ｐ１及びＰ２短縮型抗原に結合する、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２ＩｇＧ特異的患者ポリクローナル抗体）を検出するために、酵素断片を使用した。]

权利要求:

請求項1
試料中の関心のある検体の存在を調べる方法であって、試料を、基質での再構成活性酵素の作用を通じてグロー発光シグナルを生成させるために、検体とのインタラクタードメインの親和性を通じ、試料中の関心のある検体の存在下で第一及び第二のレポーター断片対メンバーが会合することを可能とするインビトロアッセイ条件下で、（ｉ）関心のある検体に対する親和性を有するインタラクタードメインを含む、精製された第一のレポーター断片対メンバー、及び（ｉｉ）関心のある検体に対する親和性を有するインタラクタードメインを含み、関心のある検体との第一及び第二のレポーター断片対メンバーのインタラクタードメインの親和性を通じた第一のレポーター断片対メンバーとの会合時に活性酵素を再構成することにおいて操作可能である、精製された第二のレポーター断片対メンバー、と接触させること、ならびにグロー発光シグナルの有無又は程度を検出することを含む、方法。
請求項2
第一及び第二のレポーター断片対メンバーが、配列番号１０で示されるウミシイタケルシフェラーゼアミノ酸配列のアミノ酸残基セリン９１とチロシン９２との間又はグリシン２２９とリジン２３０との間又は別のルシフェラーゼ配列の同等位置の間の切断点により形成されるルシフェラーゼポリペプチドのα及びω断片である、請求項１に記載の方法。
請求項3
活性酵素がウミシイタケルシフェラーゼ又はその誘導体である、請求項１に記載の方法。
請求項4
ルシフェラーゼがＣ１２４Ａ突然変異を含む、請求項３に記載の方法。
請求項5
アッセイ条件が１以上の還元剤の存在を含む、請求項１から請求項４の何れか一項に記載の方法。
請求項6
還元剤の総濃度が約１から約２％ｗ／ｖである、請求項５に記載の方法。
請求項7
アッセイ条件が変性剤の存在を含む、請求項１から請求項６の何れか一項に記載の方法。
請求項8
変性剤の総濃度が約１から約２％ｗ／ｖである、請求項７に記載の方法。
請求項9
アッセイ条件が界面活性剤の存在を含む、請求項１から請求項８の何れか一項に記載の方法。
請求項10
界面活性剤がＣＨＡＰＳである、請求項９に記載の方法。
請求項11
界面活性剤の総濃度が約０．１から約０．２％ｗ／ｖである、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
請求項12
アッセイ条件が約０．２５から０．５Ｍの塩の存在を含む、請求項１から請求項１１の何れか一項に記載の方法。
請求項13
アッセイ条件が緩衝液としてのＴｒｉｓＨＣｌの存在を含む、請求項１から請求項１２の何れか一項に記載の方法。
請求項14
アッセイ条件が、セレンテラジン類似体ｆ、ｈ及びｎからなる群から選択されるルシフェラーゼ基質の存在を含む、請求項１から請求項１３の何れか一項に記載の方法。
請求項15
第一及び第二のレポーター断片対メンバーの少なくとも１つのインタラクタードメインが１以上のエピトープを含む、請求項１から請求項１４の何れか一項に記載の方法。
請求項16
第一及び第二のレポーター断片対メンバーの少なくとも１つのインタラクタードメインが１以上の相補性決定領域を含む、請求項１から請求項１４の何れか一項に記載の方法。
請求項17
試料が血液又は血清試料などの生体試料である、請求項１から請求項１６の何れか一項に記載の方法。
請求項18
試料中での関心のある検体の存在を確認するための、均一インビトロ強制酵素断片再構成アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｉｎｖｉｔｒｏｆｏｒｃｅｄｅｎｚｙｍｅｆｒａｇｍｅｎｔｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎａｓｓａｙ）を行うためのキットであって、（ａ）関心のある検体に対する親和性を有するインタラクタードメインを含む精製された第一のレポーター断片対メンバー、（ｂ）関心のある検体に対する親和性を有するインタラクタードメインを含み、関心のある検体との第一及び第二のレポーター断片対メンバーのインタラクタードメインの親和性を通じた第一のレポーター断片対メンバーとの会合時に酵素活性を再構成することにおいて操作可能である、精製された第二のレポーター断片対メンバー、及び（ｃ）基質における活性酵素の作用を通じてグロー発光シグナルを生成させるために（グロー発光シグナルは、試料中の関心のある検体の存在を示す。）、検体とのインタラクタードメインの親和性を通じ、試料中での関心のある検体の存在下で第一及び第二のレポーター断片対メンバーが会合できるようにするインビトロアッセイ条件を提供するための試薬、を含む、キット。
請求項19
試料中の関心のある検体の存在を判定するための、請求項１８に記載のキットの使用。
請求項20
関心のある検体が抗体である、請求項１９に記載の使用。
請求項21
関心のある検体が抗原である、請求項１９に記載の使用。
請求項22
（ｉ）約１０ｎＭを超える総濃度の１以上のレポーターポリペプチド及び（ｉｉ）１以上の糖及び／又は１以上の不活性タンパク質を含む、アッセイ試薬保存組成物。
請求項23
１以上のレポーターポリペプチドが、インビトロ強制酵素再構成アッセイのためのルシフェラーゼレポーターポリペプチドである、請求項２２に記載の組成物。
請求項24
１以上のレポーターポリペプチドが約５０ｎＭを超える総濃度で存在する、請求項２２又は請求項２３に記載の組成物。
請求項25
１以上の糖が、スクロース、トレハロース及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２２から請求項２４の何れか一項に記載の組成物。
請求項26
１以上の糖の総濃度が少なくとも約５０ｍＭである、請求項２２から請求項２５の何れか一項に記載の組成物。
請求項27
１以上の不活性タンパク質が、血清アルブミン、ゼラチン及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２２から請求項２６の何れか一項に記載の組成物。
請求項28
１以上の不活性タンパク質の総濃度が少なくとも約１ｍｇ／ｍＬである、請求項２２から請求項２７の何れか一項に記載の組成物。
請求項29
約１０ｎＭを超える総濃度で、１以上のレポーターポリペプチドを含むアッセイ試薬保存組成物中で１つ又はレポーターポリペプチドを安定させるための、１以上の糖及び／又は１以上の不活性タンパク質を含む組成物の使用。
請求項30
１つ又はレポーターポリペプチドが、インビトロ強制酵素再構成アッセイに適切なルシフェラーゼレポーターポリペプチドである、請求項２９に記載の使用。